高祎婷， 海米提·肖合來提， 馬 成

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 烏魯木齊 830011)

關(guān)健詞： Combretastatin A-4(CA-4)； MTT； 乳腺癌細(xì)胞； 宮頸癌細(xì)胞； 分子對(duì)接

乳腺癌是發(fā)生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤，全球乳腺癌發(fā)病率自20世紀(jì)70年代末開始一直呈上升趨勢(shì)，2014年我國(guó)女性乳腺癌新發(fā)病例約為27.89萬例，占女性全部惡性腫瘤發(fā)病的16.51%，位居女性惡性腫瘤發(fā)病的首位[1-2]。宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，發(fā)展中國(guó)家宮頸癌患病率遠(yuǎn)高于發(fā)達(dá)國(guó)家，在發(fā)展中國(guó)家宮頸癌患病率僅次于乳腺癌而居于第二位，我國(guó)女性宮頸癌發(fā)病率從高到低依次為中、西、東部地區(qū)，西部地區(qū)的死亡率最高，這與欠發(fā)達(dá)地區(qū)女性宮頸癌篩查普及度較低、人類乳頭瘤病毒(HPV)感染率較高有關(guān)[3-4]。磷酯酰肌醇激酶(PI3K)是PI3K/Akt/mTOR通路的上游分子，正常情況下，PI3K催化PIP2磷酸化為PIP3，后者是細(xì)胞內(nèi)的第二信使，通過募集和激活下游信號(hào)分子Akt，對(duì)Akt下游的信號(hào)蛋白如mTOR的磷酸化調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等[5]，在乳腺癌中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的活化高達(dá)70%[6]。李銳銳等[7]研究發(fā)現(xiàn)，PI3K 抑制劑LY294002 能夠增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性，并表現(xiàn)出時(shí)間依賴效應(yīng)，因此抑制此通路中的關(guān)鍵基因PI3K，能達(dá)到抑制乳腺癌和宮頸癌細(xì)胞的增長(zhǎng)作用，引起癌細(xì)胞凋亡[8-9]。微管蛋白抑制劑對(duì)有些多藥耐藥腫瘤細(xì)胞(如非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌和卵巢癌等)具有良好的抑制作用，有些微管蛋白抑制劑同時(shí)還具有腫瘤新生血管抑制作用[10]，CA-4是從南非灌木(Combretumcaffrum)的樹干中分離得到的一種化合物，具有較強(qiáng)的抗微管蛋白活性，作用于秋水仙堿位點(diǎn)[11]。由于其水溶較差，易形成熱力學(xué)上更穩(wěn)定，但活性更弱的反式CA-4異構(gòu)體，因此臨床上較難用藥[12]。Kamal等[13]采用苯并呋喃環(huán)取代CA-4的B的環(huán)，設(shè)計(jì)和合成出一系列CA-4的衍生物，對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的IC50值為0.08 μmol/L，顯示苯并呋喃類化合物具有良好活性，本研究對(duì)合成的苯并呋喃結(jié)構(gòu)的CA-4類衍生物(化合物I)[14-15]進(jìn)行體外抗乳腺癌及宮頸癌活性研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器371型CO2恒溫箱(美國(guó)Thermo公司)，680型酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD公司)，SSW-420-2S型恒溫水浴箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，EPICS-XL/XL-MCL型流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckmann公司)，SOPTOP型倒置顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司)，1-1SPK型高速離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)，ES-315型壓力蒸汽滅菌器(日本TOMY公司)，NDO-601SD型烘干箱(日本EYELA株式會(huì)社)，VS-840K-U型無菌紫外操作臺(tái)(美國(guó)Thermo公司)，C2型激光共聚焦顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2試藥人乳腺癌細(xì)胞株 MCF-7和人宮頸癌細(xì)胞株Siha(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫)。特級(jí)胎牛血清(FBS)(天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司，批號(hào)TBD0110HYT)，Hoechst 33342染色液(北京Solarbio，批號(hào)C0031)，二甲基亞砜( DMSO)(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)7235950)，BD-Pharmingen 556547 Annexin V PE細(xì)胞凋亡試劑盒(美國(guó)BD Biosciences公司，批號(hào)559763)，碘化丙啶/核糖核酸酶染色溶液(美國(guó)BD Biosciences公司，批號(hào)8019561)，Combretastatin A-4陽性藥(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)CA0815QB14)，化合物I((E)-3-(6-甲氧基-2-(1-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙烯基)苯并呋喃-5-基)甲酸，C22H20O8),見圖1。

圖1CA-4及化合物I結(jié)構(gòu)圖

2 方法與結(jié)果

2.1方法

2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取MCF-7 接種于10%胎牛血清+1%雙抗+1%谷氨酰胺的MEM培養(yǎng)基，取SiHa接種于10%胎牛血清+1%雙抗+1%谷氨酰胺的DMEM高糖培養(yǎng)基，環(huán)境為37℃、5%CO2，2～3 d換液、傳代1次。

2.1.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 分別將MCF-7和SiHa細(xì)胞以5×104個(gè)/mL的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，每組6個(gè)復(fù)孔設(shè)置8組(每組代表1 d)。每天加入1組MTT測(cè)定吸光度值(OD),連續(xù)測(cè)定8 d，以每天的平均OD值為縱軸，天數(shù)為橫軸，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

2.1.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué) 將MCF-7和SiHa細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度均勻接種于激光共聚焦專用玻璃皿，用化合物I(1、5、15 μmol/L)及5 μmol/L CA-4處理細(xì)胞24 h后，按照Hoechst 33342染色液(1 mg/mL)使用說明加入1 mL染色液，37℃、5%CO2孵育30 min，棄染色液，用PBS洗滌1次，在激光共聚焦下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照。

2.1.4 MTT實(shí)驗(yàn) 分別將MCF-7和SiHa細(xì)胞以5×104個(gè)/mL的密度接種于96孔板，每孔加100 μL，置于37℃、5%CO2恒溫箱24 h。藥物組每孔加入100 μL濃度分別為0.1、1.0、5.0、15.0、50.0、100.0 μmol/L的藥液、陰性對(duì)照組只加細(xì)胞液、陽性對(duì)照組為系列濃度的CA-4、空白對(duì)照只加培養(yǎng)液，各濃度組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔。置于37℃、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)48 h后，吸掉孔內(nèi)液體，加入現(xiàn)配含5 mg/mL 10%的MTT培養(yǎng)液100 μL，孵育4 h后，棄孔內(nèi)液體，加入150 μLDMSO，振蕩30 s，待紫色結(jié)晶物完全溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處OD值，計(jì)算化合物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率%=[1-(藥物處理組OD值-空白對(duì)照組OD值)/(陰性對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值)]×100% 。

2.1.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 將MCF-7和SiHa細(xì)胞分別以1×105個(gè)/mL均勻接種于6孔板，用化合物I(0.1、1.0、5.0 μmol/L)處理細(xì)胞48 h。收集細(xì)胞，并重懸于100 μL的Bingding Buffer中。而后向細(xì)胞中加入FITC Annexin V和PI各5 μL，室溫下避光15 min后補(bǔ)加400 μL Bingding Buffer，用濾網(wǎng)過濾到流式管后上機(jī)檢測(cè)。

2.1.6 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn) 將MCF-7和SiHa細(xì)胞以3×105個(gè)/mL均勻接種于6孔板，用化合物I(0.1、1.0、5.0、15.0 μmol/L)處理細(xì)胞48 h。收集細(xì)胞，加入預(yù)冷的75%乙醇，-20℃固定過夜，加入PI/RNase Staining Buffer 400 μL室溫下避光30 min，用濾網(wǎng)過濾入流式管后上機(jī)檢測(cè)。

2.1.7 分子對(duì)接 使用PyMoL 1.7.6軟件提取PI3K蛋白與3K6復(fù)合物的A鏈，含1單元的PI3Kα蛋白和1分子3K6配體結(jié)構(gòu)。使用AutodockTools 1.5.6軟件刪除水分子、添加極性氫和電荷，轉(zhuǎn)化為PDBQT格式。然后用ChemBioDraw Ultra 14.0軟件畫出小分子12的結(jié)構(gòu)，用ChemBio3D Ultra 14.0軟件轉(zhuǎn)化為三維結(jié)構(gòu)，并使用MMFF94力場(chǎng)進(jìn)行能量?jī)?yōu)化，最后用AutodockTools 1.5.6轉(zhuǎn)化為PDBQT格式用于分子對(duì)接。

2.2結(jié)果

2.2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 SiHa細(xì)胞培養(yǎng)第1天與第2天相比，OD值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其在第1天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；MCF-7細(xì)胞在生長(zhǎng)的第2天與第3天比較，OD值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其在第2天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，見表1。

表1 SiHa及MCF-7生長(zhǎng)OD值

2.2.2 化合物I對(duì)SiHa及MCF-7細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響 與陰性對(duì)照組相比，加藥后MCF-7及Siha細(xì)胞熒光強(qiáng)度增加，細(xì)胞數(shù)量下降，并出現(xiàn)核破裂、濃縮等細(xì)胞凋亡表現(xiàn)，隨著藥濃度的增加，SiHa 及MCF-7細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象更加明顯，見圖2。

2.2.3 化合物對(duì)SiHa及MCF-7細(xì)胞增殖的影響 化合物I對(duì)MCF-7和SiHa 2種腫瘤細(xì)胞有良好的抗增殖活性，且隨著化合物濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率總體呈上升趨勢(shì)?；衔颕對(duì)SiHa細(xì)胞的IC50值為1.10 μmol/L，強(qiáng)于陽性對(duì)照藥CA-4；化合物I對(duì)MCF-7細(xì)胞的IC50值為0.89 μmol/L，與陽性對(duì)照藥CA-4相當(dāng)，見表2、3。

SiHa(0 μmol/L)

化合物I(1 μmol/L)

化合物I(5 μmol/L)

化合物I(15 μmol/L)

CA-4(5 μmol/L)

MCF-7(0 μmol/L)

化合物I(1 μmol/L)

化合物I(5 μmol/L)

化合物I(15 μmol/L)

CA-4(5 μmol/L)

圖2 化合物I對(duì)SiHa及MCF-7細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響

注：與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05。

表3 化合物I和CA-4體外抗SiHa和MCF-7細(xì)胞的IC50值

2.2.4 細(xì)胞生長(zhǎng)周期結(jié)果 與陰性對(duì)照組相比，給藥后,化合物I的濃度從0.1 μmol/L增加到15.0 μmol/L，SiHa細(xì)胞在G2期占比從15.42%增加到89.77%，MCF-7細(xì)胞在G2期占比從15.06%增加到64.12%，并且呈濃度依賴型。當(dāng)以15.0 μmol/L濃度給藥CA-4時(shí)，得到SiHa細(xì)胞在G2期占比為83.37%,MCF-7細(xì)胞在G2期占比為65.92%，見圖3、表4。

SiHa(0 μmol/L)

化合物I(0.1 μmol/L)

化合物I(1.0 μmol/L)

化合物I(5.0 μmol/L)

化合物I(15.0 μmol/L)

CA-4(15.0 μmol/L)

MCF-7(0 μmol/L)

化合物I(0.1 μmol/L)

化合物I(1.0 μmol/L)

化合物I(5.0 μmol/L

化合物I(15.0 μmol/L)

CA-4(15.0 μmol/L)

圖3 不同濃度化合物I和CA-4作用48 h后SiHa和MCF-7細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖

2.2.5 細(xì)胞凋亡結(jié)果 Q1表示細(xì)胞株中機(jī)械損傷細(xì)胞，Q2表示晚期凋亡細(xì)胞，Q3表示細(xì)胞株中的正常細(xì)胞，Q4表示早期調(diào)亡細(xì)胞，Q2+Q4為總凋亡。與陰性對(duì)照組相比，給藥后，當(dāng)化合物I的濃度從0.1 μmol/L增加到5.0 μmol/L時(shí)，SiHa細(xì)胞總凋亡率從14.30%增加到71.70%，MCF-7細(xì)胞總凋亡率從19.40%增加到59.20%，并且呈濃度依賴型。當(dāng)以1.0 μmol/L濃度給藥CA-4時(shí)SiHa細(xì)胞總凋亡率為51.30%；MCF-7細(xì)胞總凋亡率為36.70%?；衔颕具有強(qiáng)烈的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，隨著給藥濃度的增加，細(xì)胞早晚期總凋亡比例升高，且對(duì)SiHa細(xì)胞的促凋亡作用更強(qiáng)，見圖4、表5。

表5 化合物I及CA-4對(duì) SiHa 和 MCF-7細(xì)胞促凋亡作用結(jié)果

SiHa(0 μmol/L)

化合物I(0.1 μmol/L)

化合物I(1.0 μmol/L)

化合物I(5.0 μmol/L)

CA-4(5.0 μmol/L)

MCF-7(0 μmol/L)

化合物I(0.1 μmol/L)

化合物I(1.0 μmol/L)

化合物I(5.0 μmol/L)

CA-4(5.0 μmol/L)

圖4化合物I及CA-4對(duì)SiHa和MCF-7細(xì)胞的凋亡作用圖

2.2.6 分子對(duì)接結(jié)果 采用AutoDock Vina 1.1.2程序?qū)⒕w結(jié)構(gòu)中的3K6配體和PI3Kα蛋白進(jìn)行了重對(duì)接研究。重對(duì)接得到3K6和PI3Kα蛋白結(jié)合的最低能量為-9.8 kcal/mol，化合物I的最低結(jié)合能為-8.0 kcal/mol，顯示化合物I和PI3Kα蛋白可以較好的嵌合，但是結(jié)合強(qiáng)度弱于3K6配體。在結(jié)合自由能分析中得到化合物I和蛋白之間具有較強(qiáng)的結(jié)合力，3,4,5-三甲氧基苯基可以與氨基酸殘基Trp-780形成CH-π相互作用，而化合物I的苯并呋喃環(huán)骨架位于另一個(gè)由氨基酸殘基Met-800、Ile-848和Ile-932所形成的疏水性腔袋，形成穩(wěn)定的疏水性相互作用，再者化合物I的羰基氧和羧基氧可以分別和氨基酸殘基Ser-854和Asp-933形成雙重氫鍵，氫鍵距離為2.6?(強(qiáng)鍵)和3.4?(弱鍵)。這些氫鍵作用使小分子I和PI3Kα蛋白結(jié)合成穩(wěn)定復(fù)合物的主要親和力，見圖5～8。

圖5 化合物I的平面(A)和立體(B)結(jié)構(gòu)圖

圖6基于3K6確定的對(duì)接口袋綠色卡通模型為4WAF中的A鏈的PI3Kα蛋白結(jié)構(gòu)圖

圖7化合物I和3K6結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合模式圖

圖8化合物I在3K6結(jié)合位點(diǎn)與PI3Kα蛋白的結(jié)合模式圖

3 討論

化合物I含有多個(gè)親水基團(tuán)可以形成氫鍵，增加了水溶性，活性較好，對(duì)于MCF-7細(xì)胞，化合物I的抗增殖作用與陽性對(duì)照藥物CA-4相當(dāng)；對(duì)于SiHa細(xì)胞，化合物I的作用強(qiáng)于對(duì)照藥物CA-4。分子對(duì)接表明化合物12可與PI3K形成穩(wěn)定復(fù)合物。

化合物I對(duì)MCF-7及SiHa細(xì)胞具有較好的抗增殖活性，是治療癌癥的潛在分子目標(biāo)，與陽性對(duì)照組相比，無論從凋亡還是周期上均顯示出其活性優(yōu)勢(shì)，且分子對(duì)接研究從分子水平對(duì)化合物I與PI3Kα蛋白的結(jié)合模式給予了合理的解釋，為進(jìn)一步研究新型PI3K蛋白抑制劑奠定了理論基礎(chǔ)，也為研究PI3K通路[17]提供了思路，后期將對(duì)其進(jìn)一步研究探索。