白藜蘆醇對晚期糖基化終末產(chǎn)物誘導INS-1細胞損傷的保護作用及機制

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(1.江漢大學武漢生物醫(yī)學研究院,湖北武漢 430056; 2.太和醫(yī)院臨床營養(yǎng)科,湖北十堰 442008)

晚期糖基化終末產(chǎn)物(Advanced glycation end products,AGEs)是在持續(xù)的高血糖狀態(tài)下,高糖與蛋白質(zhì)通過非酶促反應形成穩(wěn)定的不可逆的終末產(chǎn)物[1-2]。AGEs在組織器官內(nèi),尤其是血管內(nèi)皮、上皮細胞處逐漸蓄積,進而誘導一系列炎癥和氧化應激等級聯(lián)反應[3-4],因而在糖尿病及其并發(fā)癥,如糖尿病腎病、動脈粥樣硬化和糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[5-8]。新近研究表明,AGEs還可直接誘導胰島β細胞凋亡,并導致胰島β細胞合成胰島素功能障礙[9]。因此,深入研究AGEs對胰島β細胞損傷的作用機制,以及開發(fā)有效的干預保護藥物,對臨床防治糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展均具有重要意義。

白藜蘆醇(Resveratrol,RSV)是一種多酚類化合物,主要存在于花生、葡萄、虎杖、桑椹等植物中,最早于1924年被發(fā)現(xiàn)[10-11],隨著人們對RSV的深入研究發(fā)現(xiàn),RSV具有抗氧化、抗炎、抗衰老和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[12]。然而,目前關于RSV對AGEs的干預研究主要集中在血管內(nèi)皮、上皮細胞上[13-14],對胰島β細胞損傷的保護作用未見文獻報道。因此,研究RSV對INS-1細胞AGEs損傷的保護作用及機制,對防治糖尿病具有重要意義。

本實驗以大鼠胰島素瘤細胞INS-1為研究對象,通過體外合成糖化血清(Glycated serum,GS),并使用含有AGEs的GS構(gòu)建INS-1細胞損傷模型[15],觀察不同劑量RSV對AGEs損傷的胰島細胞的保護作用,并初步探討其抗氧化應激作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大鼠胰島素瘤細胞(INS-1) 上海博谷生物科技有限公司;RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)、0.25%胰蛋白酶消化液、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、青鏈霉素溶液 Gibco公司;超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)檢測試劑盒、還原性谷胱甘肽(Glutathione,GSH)檢測試劑盒和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所;Mouse AGEs ELISA Kit檢測試劑盒 武漢貝茵萊生物科技有限公司;TNF-α檢測試劑盒 美國Biosource公司;BCA蛋白濃度檢測試劑盒 武漢博士德生物工程有限公司;一氧化氮(Nitric oxide,NO)檢測試劑盒 碧云天生物技術研究所;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT)、2,7-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)熒光探針、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)、白藜蘆醇(Resveratrol,RSV) Sigma公司;牛血清白蛋白(Bovine albumin,BSA) Biosharp生物科技公司;D-葡萄糖 上海生工生物工程股份有限公司進口分裝;RPMI-1640完全培養(yǎng)基(包含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)。

Heraguard ECO型超凈工作臺、371型CO2培養(yǎng)箱、Multi skan FC型全波長酶標儀、Multiskan Spectrum型熒光酶標儀、Heraeus Multifuge X1R型臺式離心機、PICO 17型離心機、240 VAC型微孔板振蕩器 Thermo Scientific公司;Nikon Ts 2型倒置顯微鏡 尼康映像儀器銷售有限公司;TDZ4-WS型臺式低速離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司;UP-250型超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 GS的制備及AGEs濃度測定 GS的制備參考Zhu等[15]的方法稍加修改,即4.5 g的D-葡萄糖溶解于50 mL胎牛血清中,旋渦器下混合均勻,混合液澄清且無可見固態(tài)物質(zhì)表示完全溶解。0.22 μm微孔濾膜過濾除菌,37 ℃恒溫避光孵育3周。孵育結(jié)束后,用pH=7.4的PBS進行透析,薄層色譜法[16]驗證D-葡萄糖被完全去除后,再次用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌,分裝成5 mL/支,-20 ℃保存,此為GS。

ELISA試劑盒檢測GS中AGEs的含量(注意將受試GS調(diào)整至試劑盒檢測濃度范圍),嚴格按照AGEs試劑盒說明書上的步驟進行操作,以標準品的濃度為橫坐標,A值為縱坐標,先繪制出標準曲線,再用標準品的濃度與A值計算出標準曲線的回歸方程式,最后將樣品的A值代入方程式,還原稀釋倍數(shù),計算出GS中AGEs的濃度。

1.2.2 INS-1細胞培養(yǎng)及分組 INS-1細胞用RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng),其中含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素,置于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育48 h,倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況,細胞融合度(貼壁細胞占整個培養(yǎng)瓶面積的比例)達到80%～90%時,以1∶2～1∶3比例傳代。

1.2.2.1 細胞造模實驗 實驗共分為4組,分別加入不同濃度的GS(0、5%、10%、20%),MTT法檢測細胞增殖率,確定后續(xù)實驗中最適GS的濃度。

1.2.2.2 受試物劑量摸索實驗 實驗共分為9個組,分別加入不同濃度的RSV(0、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400 μmol/L),MTT法檢測細胞增殖率,確定后續(xù)實驗中RSV的使用濃度范圍。

1.2.2.3 最終受試物保護功能實驗 實驗共分為5個組,分別為對照組、20% GS模型組、20% GS+25 μmol/L RSV組、20% GS+50 μmol/L RSV組、20% GS+100 μmol/L RSV組,MTT法檢測細胞增殖率,探討RSV對AGEs損傷INS-1細胞的保護作用。

1.2.3 INS-1細胞增殖率的測定 INS-1細胞增殖率測定采用MTT法。細胞培養(yǎng)48 h,融合度達到80%～90%時,0.25%胰蛋白酶消化,室溫下,1000 r/min離心5 min,1640完全培養(yǎng)液重懸細胞,并將密度調(diào)整約為1×105個/mL,取100 μL/孔接種至96孔板中,5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h,然后按實驗分組分別加入20% GS、20% GS+25 μmol/L RSV、20% GS+50 μmol/L RSV和20% GS+100 μmol/L RSV,150 μL/孔,每組設置6個復孔,同時設立無藥對照孔和無細胞空白孔,培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育48 h。處理結(jié)束后,倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照,然后加入15 μL的無菌MTT(5 mg/mL)溶液,置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。處理結(jié)束后小心吸棄上清,每孔加入150 μL DMSO,室溫下,微孔板振蕩器充分振蕩使紫色結(jié)晶完全溶解,酶標儀570 nm波長檢測吸光度值(A),計算細胞增殖率(%)=(A樣品組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100

1.2.4 細胞裂解液中SOD酶活力和GSH含量的測定 INS-1細胞接種、分組給藥和孵育時間與上述1.2.3一致。處理結(jié)束后,收集細胞培養(yǎng)液上清-20 ℃保存,然后用無菌PBS洗滌3次,0.25%胰蛋白酶消化后,室溫下,1000 r/min離心5 min,棄上清加適量的PBS重新懸浮細胞,冰浴下,超聲破碎細胞,超聲條件為:20 KHz,持續(xù)5 s,間隔10 s,重復三次。4 ℃,12000 r/min離心15 min,取上清,嚴格按照SOD和GSH試劑盒說明書上的操作步驟,測定各組細胞中SOD活力和GSH含量,每組做三個重復,同時使用BCA法測定總蛋白濃度。

1.2.5 細胞培養(yǎng)液中NO含量的測定 取1.2.4收集到的細胞培養(yǎng)液,4 ℃,1000 r/min離心10 min,離心后取上清,然后嚴格按照NO試劑盒說明書上的操作步驟，測定各組細胞培養(yǎng)液中NO的含量,每組做六個重復。

1.2.6 細胞中ROS含量的測定 INS-1細胞接種、分組給藥和孵育時間與上述1.2.3一致。吸棄細胞上清,PBS漂洗,加入終濃度為100 μmol/L的DCFH-DA,繼續(xù)將細胞置于培養(yǎng)箱孵育30 min。棄上清,PBS漂洗3次,充分除去殘余的DCFH-DA。PBS收集細胞,熒光酶標儀測定各組吸光度值,測定條件:激發(fā)波長485 nm,發(fā)射波長538 nm。每組做三個重復。

1.2.7 細胞裂解液中MDA含量的測定 INS-1細胞處理與1.2.4中完全一致。然后嚴格按照MDA試劑盒說明書上的操作步驟,測定各組細胞中MDA含量,每組做三個重復,同時使用BCA法測定總蛋白濃度。

1.2.8 細胞培養(yǎng)液中TNF-α含量的測定 取1.2.4收集到的細胞培養(yǎng)液,4 ℃,1000 r/min離心10 min,離心后取上清,然后嚴格按照TNF-α試劑盒說明書上的操作步驟,測定各組細胞培養(yǎng)液中TNF-α的含量,每組做六個重復。

1.3 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析,各組間比較采用單因素方差分析(One Way ANOVA),以p<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義,用GraphPad Prism 5作圖,結(jié)果用實驗的平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 GS中AGEs濃度的分析

ELISA試劑盒檢測GS中AGEs的含量,以標準品的濃度為縱坐標,A值為橫坐標,先繪制出標準曲線,再用標準品的濃度與A值計算出標準曲線的回歸方程式:y=110.8x2+1045x-42.61(如圖1所示),最后將樣品的A值代入方程式,計算出GS中AGEs的濃度,計算得出GS中AGEs的濃度為(47.80±0.18) μg/mL。

圖1 計算GS中AGEs含量的標準曲線方程Fig.1 Standard curve equction for calculating AGEs content in GS

2.2 GS對INS-1細胞增殖率的影響

GS對INS-1細胞增值率的影響實驗結(jié)果如圖2所示,與對照組相比,用5%、10%、20%的GS處理INS-細胞后,細胞增殖率均極顯著降低(p<0.01),表明GS能明顯抑制INS-1細胞增殖。其中20% GS對INS-1細胞增殖率抑制最明顯,因此,在后續(xù)的實驗中,采取20% GS來建立細胞損傷模型。

圖2 GS對INS-1細胞增殖率的影響Fig.2 Effect of GS on proliferation rate of INS-1 cells 注:與對照組相比,**p<0.01表示極顯著差異,圖3同。

2.3 RSV對INS-1細胞增殖率的影響

RSV對INS-1細胞增殖率的影響如圖3所示,與對照組比較,25、50和100 μmol/L的RSV處理組細胞存活率極顯著升高(p<0.01),表明RSV能顯著提高INS-1細胞的增殖。200和400 μmol/L的RSV處理組細胞增殖率極顯著降低(p<0.01),表明高濃度的RSV對INS-1細胞具有明顯的毒性作用。因此后續(xù)將使用25、50和100 μmol/L的RSV在GS損傷細胞模型中進行實驗。

圖3 RSV對INS-1細胞增殖率的影響Fig.3 Effect of RSV on proliferation rate of INS-1 cells

2.4 RSV對AGEs損傷INS-1細胞生長的影響

2.4.1 對INS-1細胞增殖率的影響 實驗結(jié)果如圖4所示,與對照組相比,20% GS模型組細胞增殖率極顯著降低(p<0.01);與20% GS模型組相比,RSV(25 μmol/L)組INS-1細胞增殖率極顯著升高(p<0.01);RSV(50 μmol/L)組INS-1細胞增殖率顯著升高(p<0.05);RSV(100 μmol/L)組INS-1細胞增殖率無顯著差異(p>0.05)。因此,后續(xù)將使用25和50 μmol/L的RSV進一步進行RSV的保護作用及機制研究。

圖4 RSV對GS損傷INS-1細胞增殖率的影響Fig.4 Effect of RSV on proliferation rate of GS injured INS-1 cells注:與對照組相比,*p<0.05表示顯著差異,**p<0.01表示極顯著差異;與20% GS模型組相比,#p<0.05表示顯著差異,##p<0.01表示極顯著差異;圖6～圖8同。

2.4.2 INS-1細胞的生長形態(tài)的變化 RSV對AGEs損傷INS-1細胞的生長情況如圖5所示,對照組細胞生長形狀規(guī)則,多呈梭型,緊貼在培養(yǎng)板壁上;20% GS模型組視野中細胞數(shù)目明顯減少,細胞處于半貼壁狀態(tài),多呈橢圓形;與20% GS模型組比,25和50 μmol/L的RSV組細胞數(shù)目明顯增多,細胞貼壁情況也較好,大部分呈梭型,少部分呈橢圓形。

圖5 光學顯微鏡下觀察INS-1細胞的生長形態(tài)(100×)Fig.5 Growth morphology of INS-1 cells under optical microscope(100×)

2.5 RSV對AGEs誘導的INS-1細胞SOD活性和GSH含量的影響

RSV對AGEs誘導INS-1細胞氧化應激反應的影響實驗結(jié)果如圖6所示,與對照組相比,20% GS模型組細胞的SOD活性和GSH含量極顯著降低(p<0.01);與20% GS模型組相比,25和50 μmol/L的RSV組細胞的SOD活性和GSH含量極顯著升高(p<0.01)。

圖6 RSV對AGEs誘導的INS-1細胞SOD活性和GSH含量的影響Fig.6 Effects of RSV on SOD activities and GSH content in INS-1 cells induced by AGEs

2.6 RSV對AGEs誘導INS-1細胞NO、ROS和MDA含量的影響

RSV對AGEs誘導INS-1細胞產(chǎn)生有害自由基的保護作用實驗結(jié)果如圖7所示,與對照組相比,20% GS模型組細胞培養(yǎng)液中的NO和細胞內(nèi)的ROS、MDA含量顯著升高(p<0.05);與20% GS模型組相比,25和50 μmol/L的RSV組細胞培養(yǎng)液中的NO含量極顯著降低(p<0.01),50 μmol/L的RSV組細胞內(nèi)的ROS含量顯著降低(p<0.05),25 μmol/L的RSV組細胞內(nèi)的ROS含量有下降趨勢,但無顯著差異(p>0.05),25 μmol/L的RSV組細胞的MDA含量顯著降低(p<0.05),50 μmol/L的RSV組細胞的MDA含量有降低趨勢,但無顯著差異(p>0.05)。

圖7 RSV對AGEs誘導INS-1細胞NO、ROS和MDA含量的影響Fig.7 Effects of RSV on the content of No,ROS and MDA in INS-1 cells induced by AGEs

2.7 RSV對AGEs誘導INS-1細胞TNF-α表達的影響

RSV對AGEs誘導INS-1細胞生成炎性因子的影響實驗結(jié)果如圖8所示,與對照組相比,20% GS組細胞培養(yǎng)液中的TNF-α含量極顯著升高(p<0.01);與20% GS組相比,25和50 μmol/L的RSV組細胞培養(yǎng)液中的TNF-α含量極顯著降低(p<0.01)。

圖8 RSV對AGEs誘導INS-1細胞TNF-α表達的影響Fig.8 Effects of RSV on TNF-α expression of INS-1 cells induced by AGEs

3 討論與結(jié)論

糖尿病是一種復雜的、受多因素影響的慢性代謝性疾病,胰島β細胞的功能障礙和凋亡是糖尿病病程中持續(xù)高血糖的主要原因[17-19]。新近研究表明,AGEs與胰島β細胞功能障礙或凋亡關系密切[20]。細胞和動物實驗中發(fā)現(xiàn),AGEs可引起胰島β細胞凋亡并導致胰島β細胞合成胰島素功能障礙[21]。本實驗結(jié)果顯示，含一定濃度AGEs的GS能明顯抑制INS-1細胞的增殖,且GS濃度越高,細胞增殖率越低,此結(jié)果與相關文獻報道一致[15]。20% GS模型組INS-1細胞的SOD活性和GSH含量極顯著降低(p<0.01),NO、ROS和MDA含量顯著升高(p<0.05),TNF-α合成和釋放極顯著增加(p<0.01)說明GS對INS-1細胞具有氧化應激損傷和炎性損傷作用。

RSV已被證明具有抗氧化、抗炎、抗衰老和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[12,22]。本實驗結(jié)果顯示,25和50 μmol/L濃度的RSV能明顯提高GS損傷INS-1細胞的增殖率,表明RSV對GS造成的胰島β細胞損傷具有明顯的保護作用。此結(jié)果與現(xiàn)有RSV對血管內(nèi)皮細胞糖基化損傷的保護作用的研究結(jié)果相符合[14]。鑒于目前還沒有以AGEs為靶點的臨床治療藥物,因此深入研究RSV對AGEs損傷胰島β細胞的保護作用具有重要意義。

RSV(25和50 μmol/L)與20% GS共處理后,INS-1細胞的SOD活性和GSH含量極顯著升高(p<0.01),說明RSV能夠顯著增強INS-1細胞的抗氧化能力,降低AGEs誘導的氧化損傷;25和50 μmol/L的RSV組NO合成和分泌水平極顯著下降(p<0.01),50 μmol/L的RSV組ROS含量顯著降低(p<0.05),25 μmol/L的RSV組MDA含量下顯著降低(p<0.05),說明了RSV能夠顯著增強細胞清除細胞內(nèi)有害自由基的能力,降低自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應;25和50 μmol/L的RSV組均能極顯著降低(p<0.01)INS-1細胞的TNF-α水平,說明了RSV能夠明顯降低炎性因子合成和分泌。表明RSV可以有效緩解由AGEs引起的氧化應激和炎癥反應，從而對胰島β細胞損傷具有保護作用。

綜上所述,AGEs對INS-1細胞生長具有明顯抑制作用,并能促進INS-1細胞氧化應激和炎癥發(fā)應。RSV能顯著抑制AGEs誘導的氧化應激和炎癥反應,顯著提高AGEs損傷細胞的增殖率,表明了RSV對AGEs造成細胞損傷具有顯著的保護作用,其機制可能是因為RSV在一定程度上能夠增強INS-1細胞清除自由基的能力,提高INS-1細胞的抗氧化能力,降低INS-1細胞炎性因子水平。這為進一步深入研究AGEs對胰島β細胞損傷的作用機制以及開發(fā)有效的干預保護藥物,為今后RSV在臨床防治糖尿病上提供了有力的實驗基礎。