詹麗娥　陸冰洋　劉華棟　王彩先　唐娟　詹海杰　丁樹(shù)榮

摘要：傳染性法氏囊?。↖nfectious bursal disease，IBD）是由傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal diseasevirus，IBDV）引起的雞和火雞的一種急性、高度接觸性傳染病。本實(shí)驗(yàn)從山西省不同地區(qū)疑似法氏囊病雞中分離到法氏囊病毒，經(jīng)雞胚培養(yǎng)繁殖、電鏡觀察、提取RNA、設(shè)計(jì)引物、cDNA的PCR擴(kuò)增、電泳、測(cè)序。通過(guò)序列分析比對(duì)，最后鑒定其為傳染性法氏囊病毒株。

關(guān)鍵詞：法氏囊病毒；分子鑒定；VP2基因

雞傳染性法氏囊病（IBD）于1957年首次在美國(guó)東海岸特拉華州南部岡博羅城的肉雞群中發(fā)現(xiàn)，因此也稱“岡博羅”病，Wint-orfield于1962年從患病的小雞雞胚中分離出病毒，1972年定名為雞傳染性法氏囊病。80年代以后至90年代以來(lái)歐洲國(guó)家出現(xiàn)了致死率很高的超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病病毒株（very virulent IBDV，vvIBDV）。vvIBDV的流行特點(diǎn)及病原特性：對(duì)雞具有很強(qiáng)的致病性，雞對(duì)IBD最易感階段為3～6周齡，vvIBDV不僅能感染有較高母源抗體的3周齡以內(nèi)的雛雞，而且也能引起大周齡雞發(fā)病；死亡率高；引起嚴(yán)重的法氏囊損傷是vvIBDV的又一顯著特點(diǎn)：病死雞的法氏囊顯著腫大，嚴(yán)重出血，有的外觀呈“紫葡萄”樣。幾十年來(lái)，已遍及幾乎所有養(yǎng)雞國(guó)家，給各國(guó)養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。傳染性法氏囊病超強(qiáng)毒（IBDV）引起雞的免疫抑制，導(dǎo)致新城疫、馬立克氏、禽流感、傳染性支氣管炎和球蟲(chóng)等病免疫失敗。近年來(lái)，山西省及全國(guó)一些地方由于超強(qiáng)毒株的流行，導(dǎo)致常用的傳統(tǒng)IBD弱毒疫苗和滅活疫苗不能提供足夠的保護(hù)，而造成免疫失敗，也使本病的流行出現(xiàn)了新的特點(diǎn)，從而更加重了對(duì)養(yǎng)禽業(yè)的危害。超強(qiáng)毒株能夠沖破高水平母源抗體，破壞常規(guī)疫苗的保護(hù)作用，不僅能造成體液免疫抑制，而且對(duì)細(xì)胞免疫也有一定影響。本實(shí)驗(yàn)從山西省不同地區(qū)采集疑似法氏囊病雞病料，主要采集的法氏囊特征是腫大、表面充血、出血，呈“紫葡萄樣”；切開(kāi)可見(jiàn)黏膜彌漫性出血，并有黏稠的奶酪樣物質(zhì)覆蓋。經(jīng)病料采集處理、病毒純化繁殖、電鏡觀察、提取RNA、設(shè)計(jì)引物、cDNA的PCR擴(kuò)增、電泳、測(cè)序。通過(guò)序列分析比對(duì)，最后鑒定其為傳染性法氏囊病毒株。

1材料

1.1雞胚及雛雞

SPF蛋購(gòu)自山東省家禽研究所，由本實(shí)驗(yàn)室孵化室孵化至所需日齡雞胚。試驗(yàn)雞購(gòu)自山西某雞場(chǎng)；

1.2病料采集處理及病毒純化繁殖

1.2.1病料的采集處理從山西省不同地區(qū)疑似法氏囊病雞中采集法氏囊病料，用PBS緩沖液無(wú)菌研磨，反復(fù)離心3次，取上清液。保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2病毒純化繁殖SPF雞蛋60枚，分三批入孵，每批20枚。用常規(guī)的絨毛尿囊膜接種法，接種法氏囊病毒乳液，盲傳幾次，收獲絨毛尿囊膜和尿囊液備用。

1.3試劑及診斷液

主要試劑：DNA marker 2000為TIANGEN公司產(chǎn)品；AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒為美國(guó)AXYGEN公司產(chǎn)品；PlasmidMinikitl（100）為OMEGA BIO-TEK公司產(chǎn)品；堿法質(zhì)粒提取溶液Solution Ⅰ、Solution Ⅱ、Solution Ⅲ參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南配制；IBDV陽(yáng)性血清和抗原購(gòu)自中國(guó)哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.4菌株及載體

大腸桿菌DH5 α由本實(shí)驗(yàn)室保存；PfastBacHTA表達(dá)載體及相關(guān)產(chǎn)品購(gòu)自Invitrogen；PMD18-T載體為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶EcoRI、Xhol購(gòu)自NEB。

2方法

2.1病料采集處理及病毒純化繁殖

2.1.1病料的采集處理從山西省不同地區(qū)疑似法氏囊病雞中采集法氏囊病料。主要選擇法氏囊外觀水腫呈膠凍樣、出血呈紫葡萄狀。將病料反復(fù)凍融三次，充分釋放病毒粒子，增加病毒粒子含量，1：5生理鹽水無(wú)菌研磨，再等體積加入4，000IU/mL青霉素和2，000IU/mL鏈霉素的雙抗，放入-20℃保存，備用。用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)病毒效價(jià)，被檢病毒與標(biāo)準(zhǔn)法氏囊陽(yáng)性血清出現(xiàn)明顯的沉淀線。

2.1.2病毒純化繁殖取60枚SPF雞蛋，分三批入孵，每批20枚。將第一批20枚雞胚放入溫箱中，每日翻蛋2-3次，注意保持濕度。4日后入孵第二批蛋，再4日后入孵第三批蛋。當(dāng)?shù)谝慌u胚10日齡時(shí)，法氏囊病毒乳液加等體積雙抗30min；用常規(guī)的絨毛尿囊膜接種法，接種法氏囊病毒乳液；然后用熔化石蠟封口，放入溫箱繼續(xù)孵育，逐日觀察。24h內(nèi)無(wú)死亡的棄掉，48h以后死亡的雞胚放入4℃保存，120h收集死活胚放入4℃。收獲雞胚絨毛尿囊膜和尿囊液，將絨毛尿囊膜加PBS緩沖液無(wú)菌研磨，研磨后4℃放置1h，加等體積氯仿充分混勻至乳懸液，搖床過(guò)夜，反復(fù)凍融3次后，進(jìn)行第二次接毒。同上述過(guò)程進(jìn)行第三次接毒。第三次接毒收獲的絨毛尿囊膜研磨后，用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)病毒效價(jià)，被檢病毒與標(biāo)準(zhǔn)法氏囊陽(yáng)性血清出現(xiàn)明顯的沉淀線。

2.2引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)genbank登錄IBDVVP2基因參考序列和表達(dá)載質(zhì)粒pFastBacHTA表達(dá)閱讀框設(shè)計(jì)VP2基因擴(kuò)增引物：P1：5-CGGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAACC-3；P2：5-CCCTCGAGCACCGGCACAGCTATCCTCCTTAT-3：兩頭分別引入EcoRI和Xhol酶切位點(diǎn)。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2.3病毒RNA的提取

用Trizol法提取RNA，具體步驟為：取250μL病毒液于一普通的1.5mL EP管中，加入750uL Trizol，震蕩混勻，靜置5min。加入150μL氯仿，震蕩混勻，4℃離心，12，000r/min，5min。取上清加入450μL異丙醇，顛倒混勻，4℃離心，12，000r/min，12min。棄液體，加1mL75%DEPC乙醇洗滌，4℃離心，12，000r/min，5min。棄液體，虹吸，干燥沉淀。加9μL DEPC水，50℃水浴10min，開(kāi)始反轉(zhuǎn)錄。

反轉(zhuǎn)錄步驟為：10μL RNA、1μL隨機(jī)引物和4μL dNTP混勻，65℃水浴8min后迅速冰浴5min。再加入4μL Buffer、1μL反轉(zhuǎn)錄酶和1μL RNaseinhibitor，37℃水浴2-3h。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，P1和P2為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。

PCR反應(yīng)體系：5×StarBuffer 5μL，dNTP 2μL，4μL模板，P1和P2各0.5μL，Primestar 0.25μL，ddH，O12.75μL。PCR反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性10s；98℃變性10s，55℃退火15s，72℃延伸100s，共30個(gè)循環(huán)，72℃終延伸10min。凝膠電泳以鑒定分子量大小。將PCR產(chǎn)物按照AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行回收。取4.5μL回收產(chǎn)物加入5μLSollution Ⅰ和0.5μL Venter，混勻，4℃過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coli DH5 α感受態(tài)細(xì)菌，涂布在用LB配制的1.5%的瓊脂平皿上（含氨芐青霉素100mg/L），37℃培養(yǎng)14h。挑單菌落接種入LB（含氨芐青霉素100mg/L），振搖培養(yǎng)12h。按Plasmid Minikit Ⅰ（100）說(shuō)明書提取質(zhì)粒。質(zhì)粒用EcoRI和Xhol雙酶切鑒定，陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為T-VP2。送上海生工測(cè)序。

2.4分離株VP2序列分析及推導(dǎo)氨基酸序列分析

測(cè)序結(jié)果表明，分離株VP2基因核苷酸長(zhǎng)度為1389bp，推導(dǎo)氨基酸序列含有347個(gè)氨基酸，采用DNAstar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，對(duì)照IBDV經(jīng)典強(qiáng)、弱毒株及超強(qiáng)毒株高變區(qū)氨基酸序列分析分離株VP2分子特征。

2.5數(shù)據(jù)分析

分離株VP2高變區(qū)遺傳進(jìn)化樹(shù)分析應(yīng)用生物軟件DNASTAR，對(duì)分離株和其他40株登錄在GenBank中的參考毒株的VP2基因高變區(qū)（435bp）進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，參考毒株及登錄號(hào)為：JF907703.1。

3結(jié)果與分析

3.1病毒純化繁殖結(jié)果

病料經(jīng)無(wú)菌處理及雞胚繁殖、通過(guò)差速離心和密度梯度超速離心后負(fù)染、電鏡觀察表明：病毒的三維立體結(jié)構(gòu)表明，IBDV病毒顆粒并非球形，呈T=13對(duì)稱，五倍軸延伸直徑為72nm，而三倍軸延伸直徑為66nm（見(jiàn)圖1）。

3.2VP2基因擴(kuò)增結(jié)果

VP2基因擴(kuò)增圖譜（見(jiàn)圖2）。

3.3T-VP2酶切鑒定結(jié)果

T-VP2酶切鑒定結(jié)果（見(jiàn)圖3）。

3.4IBDV同源性分析結(jié)果

測(cè)序結(jié)果表明，VP2基因核苷酸長(zhǎng)度為1356bp，推導(dǎo)編碼452個(gè)氨基酸。采用DNAstar軟件將IBDV株VP2基因與國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的VP2基因核苷酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)。結(jié)果表明，IBDV株VP2核苷酸序列與日本超強(qiáng)毒株OKYM同源性最高為99.2%，與其他兩株超強(qiáng)毒株同源性高達(dá)98.9%、97.9%，而與強(qiáng)毒株52/70株和變異株variant E同源性較低分別為96.5%與96.2%，與中等毒力致弱株B87和2512、經(jīng)典弱毒株D78和Cu一1以及疫苗株CEF94同源性在96.0%～96.4%之間，與Ⅱ型毒株同源性最低分別為81.6%、81.8%（見(jiàn)圖4）。

同時(shí)，對(duì)VP2氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明IBDV VP2氨基酸序列與超強(qiáng)毒株OKYM、HK46同源性最高均為99.6%，與強(qiáng)毒株52/70同源性次之為99.1%，與弱毒株及變異株同源性相對(duì)較低，從氨基酸水平表明IBDV分離株與強(qiáng)毒株關(guān)系密切（見(jiàn)圖5）。

3.5IBDVVP2高變區(qū)氨基酸序列分析結(jié)果

IBDV分離株VP2同源性與超強(qiáng)毒株最高，而IBDV病毒毒力相關(guān)分子和致病性分子標(biāo)志主要分布在高變區(qū)，因此采用DNAstar軟件對(duì)IBDV VP2高變區(qū)與強(qiáng)毒參考毒株進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明，除222位點(diǎn)外，IBDV VP2高變區(qū)具備與超強(qiáng)毒株高變區(qū)一致的特征性氨基酸，即第249位和第254位氨基酸為O和G，SWSASGS七肽區(qū)不變，第279和第284位氨基酸分別為D和A，第294和第299位分別是特征性氨基酸I和S，盡管該分離株第222位是S而不是典型超強(qiáng)毒株的A，但其余關(guān)鍵位點(diǎn)均與強(qiáng)毒株相符（如圖6）。

3.6IBDV VP2遺傳進(jìn)化分析

根據(jù)IBDV VP2高變區(qū)核苷酸序列與參考毒株相應(yīng)序列，采用軟件MEGA 5.1構(gòu)建基因進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，這些毒株共形成2個(gè)大的分支：血清Ⅰ型和血清Ⅱ型，其中血清Ⅰ型毒株又分為超強(qiáng)毒株、強(qiáng)毒株、變異株和弱毒疫苗株4個(gè)小的分支，IBDV與強(qiáng)毒株HK46、OKYM、KSH屬同一進(jìn)化分支，親緣關(guān)系最近，與變異株、強(qiáng)毒株次之，與弱毒疫苗株親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，說(shuō)明與強(qiáng)毒株具有更密切的親緣關(guān)系（圖7）。

4討論

IBD是危害我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)的重要傳染性疾病，在我國(guó)不同地區(qū)都有發(fā)生的報(bào)道，自上世紀(jì)80年代以來(lái)，歐洲及我國(guó)相繼出現(xiàn)IBDV強(qiáng)毒株（very virulent IBDV，vvIBDV）的流行，尤其是從21世紀(jì)初變異株和強(qiáng)毒的流行，已嚴(yán)重威脅著包括我國(guó)在內(nèi)的世界養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展。在我國(guó)相繼報(bào)道了HZ株、GZ株、安徽地區(qū)分離株等，但在山西地區(qū)還未見(jiàn)有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)是首次在山西地區(qū)分離到超強(qiáng)毒株。

本病通常用疫苗預(yù)防即能取得較好的效果，但近幾年不斷的有養(yǎng)雞場(chǎng)發(fā)生大量的雞感染死亡。大多是由于IBDV變異株的抗原性和經(jīng)典疫苗株間有差異，引起免疫抑制?；蚴莢vIBDV的出現(xiàn)不僅能產(chǎn)生免疫抑制，其超強(qiáng)的致病力能導(dǎo)致雞群的高死亡率。本實(shí)驗(yàn)采樣雞場(chǎng)同樣具有較高的死亡率，其特征與國(guó)內(nèi)外雞感染超強(qiáng)毒株后臨床特征一致。

已有報(bào)道VP2攜帶宿主保護(hù)性抗原決定簇，具有至少2-3個(gè)中和性抗原位點(diǎn)，可誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體，并且有血清型特異性。另外VP2的七肽區(qū)決定其致病性和毒力。經(jīng)過(guò)對(duì)多株vvIBDV VP2的研究對(duì)比，分析出其具備3個(gè)重要特征：①在249和254位上的氨基酸分別為O和G，而非K和S，從而保證其抗原性不發(fā)生變異；②七肽區(qū)保持SWSASGS不變，且279和284位分別為D和A，而非N和T，這是IBDV毒株具有致病力的必要條件；③在222、294和299位上具有3個(gè)特征氨基酸，分別為A、I和S，這3個(gè)氨基酸使超強(qiáng)毒的親水性發(fā)生變化，從而使毒力增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)從山西地區(qū)分離到的IBDV分離株完全符合以上VP2基因的重要特征，由此可證明其為vvIBDV。