腎脫細(xì)胞支架與再細(xì)胞化技術(shù)的研究進(jìn)展

耿光瑞，李清剛，陳香美

解放軍總醫(yī)院 腎臟疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100853

腎移植是終末期腎病的首選治療方法，但腎源緊缺和移植后排斥反應(yīng)等諸多難題始終難以解決。近年來(lái)，生物工程技術(shù)的發(fā)展與進(jìn)步為器官功能重建與再生醫(yī)學(xué)注入了強(qiáng)大動(dòng)力，使其有望成為解決腎移植難題的手段。細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)是細(xì)胞分泌的膠原蛋白、彈性蛋白、蛋白多糖、透明質(zhì)酸和非膠原蛋白基質(zhì)糖蛋白等物質(zhì)，主要分布在細(xì)胞之間和膜表面，形成錯(cuò)綜復(fù)雜的大分子網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。脫細(xì)胞技術(shù)可以使細(xì)胞與組織有效分離，從而獲取我們需要的材料[1]，包括維持原有組織或器官形態(tài)并用于再細(xì)胞化的支架、組織貼片(如顆粒型或粉末型)、可注射凝膠、細(xì)胞培養(yǎng)液成分等[2]。理想的腎脫細(xì)胞支架應(yīng)具備復(fù)雜的成分、血管網(wǎng)絡(luò)和獨(dú)特的組織特異性結(jié)構(gòu)、與天然組織相同的機(jī)械強(qiáng)度等特征，并能提供微觀和宏觀的組織框架結(jié)構(gòu)，利于細(xì)胞增殖分化，最終完成工程化的器官構(gòu)建。本綜述主要對(duì)腎脫細(xì)胞支架的制作方法、脫細(xì)胞支架的質(zhì)量評(píng)價(jià)、支架再細(xì)胞化、生物打印技術(shù)等做一總結(jié)，并探討腎脫細(xì)胞支架未來(lái)發(fā)展?jié)摿懊媾R的挑戰(zhàn)。

1 腎脫細(xì)胞支架的制作方法

1.1 腎脫細(xì)胞支架的動(dòng)物選擇 人體腎是腎脫細(xì)胞支架理想來(lái)源[3]，其在組織工程學(xué)中的應(yīng)用較其他物種來(lái)源的腎更具臨床相容性。Ross等[4]于2009年首次報(bào)道了以大鼠腎制作的脫細(xì)胞支架后，陸續(xù)有學(xué)者選用如豬[5]、猴[6]的腎，Orlando等[7]2013年首次選用廢棄的人類腎?？紤]未來(lái)腎脫細(xì)胞支架成為標(biāo)準(zhǔn)品并規(guī)模量產(chǎn)的可能，因此脫細(xì)胞支架的動(dòng)物來(lái)源必須充足并能持續(xù)供應(yīng)，且未來(lái)若應(yīng)用到人體則需體積更大的器官。豬具有繁殖力強(qiáng)、成長(zhǎng)快、成熟期較短等優(yōu)點(diǎn)并且豬源器官很容易獲得，因此豬成為最有價(jià)值的候選目標(biāo)[8]。

1.2 脫細(xì)胞試劑的選擇 脫細(xì)胞的目的是去除組織中的細(xì)胞成分，保留微觀和宏觀結(jié)構(gòu)以及功能性蛋白。灌注是制備全器官腎脫細(xì)胞支架最常用、最有效的途徑，使用血管作為灌注途徑將試劑送至器官各個(gè)角落，并可最大程度降低機(jī)械力作用導(dǎo)致的ECM損傷。制作腎脫細(xì)胞支架常用的試劑主要有化學(xué)試劑、酶類及其他生物制劑[9]，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求及試劑的特點(diǎn)，選擇合適的方法。

化學(xué)試劑：過(guò)氧乙酸[10]可水解器官中的生物分子，對(duì)ECM損傷較小；乙酸[11]對(duì)器官中的糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)影響較小，但能分解膠原從而影響支架的強(qiáng)度。堿類試劑能降低纖維基質(zhì)或基質(zhì)蛋白的交聯(lián)，從而影響支架的機(jī)械強(qiáng)度[11]。非離子表面活性劑如Triton X-100不帶電荷，對(duì)蛋白和膠原損傷較小；離子型表面活性劑如十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、脫氧膽酸鈉對(duì)細(xì)胞的洗脫更加徹底，但同時(shí)對(duì)支架的損傷也較大。

酶類試劑：蛋白酶、膠原酶以及核酸酶能裂解細(xì)胞膜、細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與ECM或核酸與ECM間的黏附，但單獨(dú)使用不僅作用時(shí)間長(zhǎng)且很難完全去除細(xì)胞，殘余的酶也會(huì)對(duì)支架的再細(xì)胞化產(chǎn)生影響。Yu等[12]發(fā)現(xiàn)小劑量酶類試劑聯(lián)合其他方法對(duì)腎的脫細(xì)胞效果良好。Crapo等[13]認(rèn)為胰蛋白酶長(zhǎng)時(shí)間作用可損傷ECM超微結(jié)構(gòu)，同時(shí)消耗膠原蛋白、層黏連蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白和GAG。

其他生物試劑：螯合劑如聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)和乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)，可與Ca、Fe離子結(jié)合，有助于細(xì)胞從ECM中分離，單獨(dú)使用時(shí)不能去除組織細(xì)胞，但可破壞組織蛋白間的聯(lián)系，因此常與胰蛋白酶或表面活性劑聯(lián)合使用[14-15]。絲氨酸蛋白酶抑制劑如苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)，以及抑肽酶和亮抑肽酶可阻斷脫細(xì)胞過(guò)程中由細(xì)胞裂解釋放蛋白酶對(duì)ECM造成的損傷[16]?？股厝缜噫溍顾?、抗真菌藥兩性霉素B等常被用來(lái)減少脫細(xì)胞和再細(xì)胞化過(guò)程中的污染[17]。

1.3 常用腎脫細(xì)胞方法 脫細(xì)胞試劑的選擇主要取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊约霸噭┖徒M織的特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)最終所需的組織復(fù)雜程度越高即要求保留的成分(如生長(zhǎng)因子，宏觀、微觀結(jié)構(gòu)等)越多，則脫細(xì)胞方案越復(fù)雜(表1)。目前尚無(wú)研究系統(tǒng)比較不同脫細(xì)胞試劑、暴露時(shí)間和不同的方法對(duì)DNA去除、ECM宏觀和微觀結(jié)構(gòu)損失以及支架在體內(nèi)的影響。腎脫細(xì)胞支架常用的制作方法主要有全器官灌注法和組織切片浸泡法。

全器官灌注法：完整的脈管系統(tǒng)和合適的去細(xì)胞化試劑，是灌注法制作腎脫細(xì)胞支架的關(guān)鍵[18]。Ross等[4]首先通過(guò)灌注3% Triton X-100，含0.002 5% DNA酶的高滲溶液后，再依次灌注3% Triton X-100和4% SDS進(jìn)行腎的脫細(xì)胞化，結(jié)果表明小鼠腎ECM可保留層黏連蛋白和Ⅳ型膠原，同時(shí)能支持小鼠胚胎干細(xì)胞向腎的分化。他們同時(shí)發(fā)現(xiàn)，使用脫氧膽酸鹽代替第二步后也能達(dá)到相同的結(jié)果。

組織切片浸泡法：將腎組織進(jìn)行切片后再進(jìn)行脫細(xì)胞處理，能增大組織和試劑的接觸面積，并能使機(jī)械力直接作用于組織，且DNA的去除和ECM成分的損失程度與脫細(xì)胞過(guò)程中攪拌速度有一定關(guān)系。Nakayama等[6]將恒河猴腎制成組織切片，用磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffered saline，PBS)洗滌腎切片兩次，然后用1% SDS或1% Triton X-100進(jìn)行洗滌，8 h時(shí)首次更換脫細(xì)胞溶液，之后每48 h更換一次，直到組織透明(7 ～ 10 d)。

2 腎脫細(xì)胞支架的質(zhì)量評(píng)價(jià)

脫細(xì)胞支架內(nèi)的細(xì)胞殘余物在再細(xì)胞化的過(guò)程中可能會(huì)引起細(xì)胞相容性問(wèn)題，且移植體內(nèi)時(shí)存在不良宿主反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)[24]。目前脫細(xì)胞技術(shù)尚不能100%去除支架內(nèi)所有細(xì)胞成分，但可定量測(cè)定細(xì)胞組分如雙鏈DNA(dsDNA)、線粒體或膜相關(guān)分子如磷脂，從而對(duì)脫細(xì)胞支架質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，并預(yù)估不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)[13]。

2.1 支架結(jié)構(gòu)的完整性 腎脫細(xì)胞支架結(jié)構(gòu)的完整性，是后續(xù)灌注及植入細(xì)胞的關(guān)鍵，包括宏觀和微觀結(jié)構(gòu)的完整。前者可通過(guò)支架外觀、血管鑄型和血管網(wǎng)絡(luò)成像等方法判斷腎脫細(xì)胞支架結(jié)構(gòu)是否完整[5,25]，后者可通過(guò)H&E染色、DAPI染色判斷。機(jī)械強(qiáng)度是另一個(gè)影響支架質(zhì)量的因素，Mendoza-Novelo的研究[26]發(fā)現(xiàn)大多數(shù)表面活性劑會(huì)從支架中去除一些GAG，從而影響支架的機(jī)械強(qiáng)度；而且Conconi等[27]還發(fā)現(xiàn)隨著脫細(xì)胞試劑作用時(shí)間的延長(zhǎng)，機(jī)械強(qiáng)度下降越明顯。因此根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需要探索合適的試劑及脫細(xì)胞時(shí)間極為重要[28]。

2.2 DNA含量測(cè)定 DNA與不良宿主反應(yīng)直接相關(guān)，因此支架中定量檢測(cè)殘存的DNA極為關(guān)鍵，目前認(rèn)為脫細(xì)胞化組織應(yīng)具備以下特征[13]：1)H&E或DAPI染色未見(jiàn)細(xì)胞核；2)每毫克干重脫細(xì)胞支架含小于50 ng的DNA；3)DNA片段小于200 bp。DNA定量測(cè)量可通過(guò)市售試劑盒、碘化丙啶或雙苯甲亞胺以及凝膠電泳測(cè)得；也可將組織中加入蛋白酶K恒溫37℃約48 h，或利用組織試劑盒提取DNA并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終使用分光光度儀進(jìn)行定量測(cè)定[29]。

2.3 蛋白質(zhì)定量分析 蛋白質(zhì)定量分析有助于了解構(gòu)成ECM的蛋白質(zhì)種類及數(shù)量，以及可能發(fā)揮的作用。凝膠電泳和質(zhì)譜分析是篩選組織或器官中蛋白質(zhì)和多肽復(fù)雜環(huán)境的常用工具[30]，主要檢測(cè)的蛋白包括Ⅰ型、Ⅳ型膠原、層黏連蛋白、彈性蛋白等。熟知精確成分有助于研究人員建立仿生化的生物鏈，通過(guò)對(duì)ECM中的具體成分進(jìn)行排列組合，可構(gòu)建出適合細(xì)胞生長(zhǎng)且免疫原性可控的支架。免疫熒光主要針對(duì)腎脫細(xì)胞支架中的Ⅰ型、Ⅳ型膠原、層黏連蛋白、彈性蛋白等水平以及vwf，CD31和α1鈉-鉀ATP酶等表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)[31]。羥脯氨酸檢測(cè)主要是定量測(cè)量總膠原，二甲基亞甲基藍(lán)檢測(cè)主要用來(lái)測(cè)量總硫酸化糖胺聚糖(sulfated glycosaminoglycan，sGAG)含量。

3 腎脫細(xì)胞支架再細(xì)胞化

對(duì)腎脫細(xì)胞支架進(jìn)行再細(xì)胞化處理是生物人工腎構(gòu)建過(guò)程中最復(fù)雜的階段。目前進(jìn)行再細(xì)胞化的方法主要分為組織切片、灌注以及直接注射。組織貼片法主要用來(lái)研究脫細(xì)胞支架的成分對(duì)細(xì)胞功能的影響；灌注法是再細(xì)胞化技術(shù)重建功能性腎的最好方法；與灌注技術(shù)相比，直接將細(xì)胞注射入腎實(shí)質(zhì)則能更好地控制細(xì)胞分布和再細(xì)胞化的區(qū)域。

細(xì)胞的來(lái)源對(duì)于重建具有功能的器官十分重要。目前較為理想的再細(xì)胞化的細(xì)胞類型主要有內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞以及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。

內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞：內(nèi)皮細(xì)胞是支架內(nèi)血管通暢的前提，研究表明如果缺乏內(nèi)皮細(xì)胞即使進(jìn)行抗凝也會(huì)形成明顯的血栓[32]，因此支架在移植入體前必須實(shí)現(xiàn)再細(xì)胞化。Ko等[33]發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗體與血管壁結(jié)合，能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。Song等[17]報(bào)道的大鼠腎全器官再細(xì)胞化的方法，主要通過(guò)大鼠腎動(dòng)脈灌注人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)從輸尿管灌注新生鼠腎細(xì)胞，借由此產(chǎn)生的壓力梯度使細(xì)胞充滿整個(gè)腎，培養(yǎng)4 d后細(xì)胞可遷移至合適位置，且發(fā)揮一定的功能。上皮細(xì)胞可來(lái)源于自體，也可選自其他物種。Abolbashari等[34]將分離的豬腎原代細(xì)胞，多次注射到豬腎脫細(xì)胞支架實(shí)質(zhì)部分中，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞黏附和重建腎小管結(jié)構(gòu)，但由于在支架表面形成了創(chuàng)傷，考慮到未來(lái)移植入體，故此法不適用于全器官的再細(xì)胞化。Caralt等[25]將人腎小管上皮細(xì)胞系注入大鼠腎動(dòng)脈，并以高壓灌注促進(jìn)細(xì)胞種植，結(jié)果表明高壓灌注能使細(xì)胞通過(guò)微循環(huán)穿過(guò)血管壁，從而達(dá)到細(xì)胞定植的效果。

表1 腎脫細(xì)胞常用的試劑及方法

胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESC)：Ross等[4]首次使用ESC進(jìn)行腎脫細(xì)胞支架的再細(xì)胞化，他們通過(guò)腎動(dòng)脈和輸尿管灌注入小鼠ESC，結(jié)果證實(shí)了小血管和腎小球的再生。Batchelder等[35]從猴腎脫細(xì)胞支架的腎動(dòng)脈和輸尿管同時(shí)灌入人ESC，恒速灌注培養(yǎng)液并培養(yǎng)5 d后，在髓質(zhì)的血管或管狀腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞。Remuzzi等[32]從腎靜脈和輸尿管逆行灌注細(xì)胞，同時(shí)外部給予負(fù)壓，發(fā)現(xiàn)只有少量細(xì)胞能夠到達(dá)皮質(zhì)和髓質(zhì)且分布不均勻，隨后他們優(yōu)化了細(xì)胞種植的策略，加大灌注壓力及細(xì)胞數(shù)量，最終細(xì)胞分布情況較前明顯提高，但細(xì)胞在接種后7 d增殖顯著降低，因此仍需進(jìn)一步探索更為有效的細(xì)胞種植方法。

人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞：人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(human induced pluripotent stem cells，hiPSC)是由體細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄4種轉(zhuǎn)錄因子衍生而來(lái)的多能干細(xì)胞。Caralt等[25]將hiPSC衍生的內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)腎動(dòng)脈高壓注入脫細(xì)胞支架內(nèi)，證實(shí)細(xì)胞能從血管中轉(zhuǎn)移至管周結(jié)構(gòu)，并且在腎脫細(xì)胞支架內(nèi)分布良好。Du等[36]將hiPSC衍生的PAX-2陽(yáng)性腎祖細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞同時(shí)注入小鼠腎脫細(xì)胞支架，隨后將支架植入SCID小鼠體內(nèi)長(zhǎng)達(dá)12周；他們還發(fā)現(xiàn)腎小球有一定的尿素和肌酐清除以及白蛋白重吸收的功能，表明內(nèi)皮細(xì)胞與腎祖細(xì)胞共培養(yǎng)能促進(jìn)支架的再細(xì)胞化。因此，即使hiPSC也存在畸胎瘤的風(fēng)險(xiǎn)，但其與ESC的相同分化潛力且無(wú)倫理爭(zhēng)議的優(yōu)勢(shì)，使其有望成為未來(lái)種植細(xì)胞的熱門候選。

4 腎生物打印技術(shù)

腎再生目前存在的困難主要是如何提高脈管系統(tǒng)再細(xì)胞化的效率和選擇合適的種植細(xì)胞[37]，以及確定最佳接種細(xì)胞的方法。面對(duì)這些難題，科學(xué)家們將目光瞄向生物打印技術(shù)，希望能制造出具有高機(jī)械強(qiáng)度且生物相容性良好的人工腎[38]。Musah等[39]將hiPSC種植在生物打印的微流體片上，最終較為有效地將hiPSC誘導(dǎo)分化為足細(xì)胞，并發(fā)揮了一定功能，結(jié)果表明生物打印可以為細(xì)胞附著和分化提供材料支撐。但生物打印技術(shù)用于構(gòu)建人工腎也面臨著諸多困難，如細(xì)胞活力是生物打印過(guò)程的關(guān)鍵參數(shù)，由于打印過(guò)程中的高應(yīng)力可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[40]，而其原料不僅需要提供物理和機(jī)械支持，保證細(xì)胞存活，還應(yīng)解決打印材料的批次變化或細(xì)胞和宿主對(duì)材料的不良反應(yīng)等問(wèn)題，因此尋找滿足上述要求的生物打印材料，應(yīng)該是生物打印技術(shù)未來(lái)探求的方向。

5 結(jié)語(yǔ)

再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展與進(jìn)步為損傷修復(fù)及疾病治療提供了新選擇。在過(guò)去一段時(shí)間里，已報(bào)道較多關(guān)于脫細(xì)胞支架構(gòu)建人工腎的研究。本綜述也總結(jié)了現(xiàn)階段腎脫細(xì)胞化支架和再細(xì)胞化的方法與研究進(jìn)展?，F(xiàn)有的脫細(xì)胞方案雖然能將絕大多數(shù)細(xì)胞(＞99%)洗脫干凈，但不可避免地?fù)p傷了支架ECM成分以及機(jī)械強(qiáng)度，未來(lái)應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注脫細(xì)胞過(guò)程中如何盡可能保留支架成分及性質(zhì)。再細(xì)胞化的方案也需進(jìn)一步優(yōu)化。盡管目前誕生了幾種細(xì)胞種植的方法，也實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞定植和功能發(fā)揮，但由于腎細(xì)胞種類和數(shù)量極多，只灌注一種或幾種細(xì)胞很難真正意義上實(shí)現(xiàn)腎再生。

腎器官再生工程仍處于早期階段。實(shí)驗(yàn)室中雖已生產(chǎn)出動(dòng)物的再細(xì)胞化人工腎，也幫助我們理解了腎細(xì)胞生物學(xué)，細(xì)胞分化和重塑，但距離應(yīng)用于人體仍有巨大的差距，依然有許多困難和挑戰(zhàn)亟需解決，如怎樣利用腎脫細(xì)胞支架的特性消除遺傳以及其他因子的干擾，構(gòu)建出可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)分化的微環(huán)境等。而合適的滅菌方法、先進(jìn)的生物反應(yīng)器、甄選最佳種植細(xì)胞、合適的誘導(dǎo)細(xì)胞分化方法、實(shí)時(shí)定量評(píng)估脫細(xì)胞支架的質(zhì)量、免疫原性和生物降解、評(píng)估重建器官的生長(zhǎng)發(fā)育等方面則應(yīng)是現(xiàn)階段需要關(guān)注的問(wèn)題。