聚類分析法研究不同產(chǎn)地花生殼高效液相色譜指紋圖譜

趙 亮，陳 月，方應(yīng)國(guó)，饒桂維

(浙江樹人大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310015)

我國(guó)的花生年產(chǎn)量約為1 450萬(wàn)t以上，產(chǎn)生的花生殼約450萬(wàn)t，其中大部分被當(dāng)成廢渣丟棄或燃料使用，利用率極低[1]?；ㄉ鷼ぜs占花生質(zhì)量的30%，其中主要含半纖維和粗纖維，兩者約占花生殼質(zhì)量的75%～80%，另有粗蛋白、粗脂肪、糖類與礦物質(zhì)等成分[2]。此外，花生殼還含有一些功能成分，如黃酮類化合物、白藜蘆醇、胡蘿卜素、木糖、皂草甘等[3]。花生殼作為一種價(jià)廉、可再生的資源，是提取食物天然抗氧化劑和防腐劑的理想材料，具有廣闊的應(yīng)用前景[4]。

近年來(lái)，為提高花生殼的利用價(jià)值，科研人員對(duì)花生殼進(jìn)行了大量的研究，如用于農(nóng)用肥料、飼料、食品、復(fù)合材料、活性炭等多個(gè)領(lǐng)域[5]。薛偉等[6]以花生殼為原料制備一種無(wú)定形碳材料碳基固體酸，具有成本低、原料可再生和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。張?jiān)倮萚7]以花生殼為生物吸附劑，研究其吸附Pb2+、Cu2+、Cr3+、Cd2+、Ni2+的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)，結(jié)果表明，花生殼對(duì)5種金屬離子的吸附具有自發(fā)、吸熱和熵增的特性。目前，市場(chǎng)上銷售的花生的產(chǎn)地來(lái)源較多，質(zhì)量參差不齊，難以保證相應(yīng)的產(chǎn)品質(zhì)量，通過(guò)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，新昌小京生是全國(guó)稀有的炒食花生優(yōu)質(zhì)品種，其色、香、味俱佳，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高[8]，但有關(guān)其成分分析的研究鮮見報(bào)道。近年來(lái)，HPLC指紋圖譜作為一種研究復(fù)雜物質(zhì)體系的技術(shù)手段，被廣泛用于質(zhì)量控制等方面，具有快速準(zhǔn)確等特點(diǎn)[9]。指紋圖譜技術(shù)源于指紋鑒定學(xué)，中藥指紋圖譜通常是指能表達(dá)中藥有關(guān)化學(xué)成分的特征譜圖[10]，按照測(cè)定手段可分為化學(xué)指紋圖譜和生物指紋圖譜兩大類[11-13]。通常得到的指紋圖譜相當(dāng)復(fù)雜，人工比較難免影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，若將其與計(jì)算機(jī)圖譜解析和識(shí)別技術(shù)結(jié)合起來(lái)，其應(yīng)用前景將大為擴(kuò)展[14-15]。雖有相關(guān)報(bào)道對(duì)花生殼成分進(jìn)行了初步探索[16-17]，但未利用HPLC指紋圖譜對(duì)共有化學(xué)特征峰等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，信息也十分有限。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法對(duì)8個(gè)產(chǎn)地不同品種的花生殼進(jìn)行指紋圖譜研究及模式識(shí)別，以期為花生殼及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

選用8個(gè)花生品種作為研究材料，其產(chǎn)地及品種信息見表1。

Agilent 1100系列液相色譜儀，配有二極管陣列檢測(cè)器(Agilent公司，美國(guó))；Milli-Q超低有機(jī)物型純水系統(tǒng)(Millipore公司，美國(guó))；高速離心機(jī)LG10-2.4A(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司)；紫外分光光度計(jì)L6S(上海儀電分析儀器有限公司)；電子天平PL402-L(梅特勒-托利多儀器有限公司)；JK-100型超聲波清洗器(合肥金尼機(jī)械制造有限公司)；C型30玻璃儀器快速烘干器(長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；GM-0.33A隔膜真空泵(天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)乙腈為色譜純，甲醇、磷酸和其他試劑為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。所用溶液使用前均用0.22 μm濾膜過(guò)濾。

1.2 提取工藝

分別稱取8種花生殼各5.0 g，置于100 mL錐形瓶中，用量筒量取100.0 mL的甲醇加入錐形瓶，用保鮮膜封住瓶口，浸泡12 h后，將錐形瓶放入超聲波清洗器中超聲30 min，然后在4 000 r·min-1的條件下離心10 min，取上清液即得。

1.3 色譜條件

WondaCract ODS-2 C18(5 μm×4.6 mm×150 mm)色譜柱。流動(dòng)相為0.5%磷酸溶液(A)和乙腈(B)；洗脫程序：0～10 min，80%～70% A；10～20 min，70%～60% A；20～35 min，60%～30% A；35～45 min，30%～20% A；45～55 min，20%～30% A；流速1 mL·min-1；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

1.4.1 提取溶劑的選擇

稱取S6花生殼5.0 g，取3份，各置于100 mL錐形瓶中，分別加入相同體積的甲醇、乙醇、乙腈，浸泡12 h后，超聲30 min，在4 000 r·min-1的條件下離心10 min，取上清液過(guò)濾，在1.3節(jié)的的色譜條件下分別進(jìn)樣分析，確定提取溶劑的類型。上述不同溶劑提取實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)取平均值。

表1 供試花生的產(chǎn)地及品種

1.4.2 色譜分析波長(zhǎng)及流動(dòng)相的選擇

根據(jù)1.2節(jié)中的方法分別制備8種花生殼的供試樣品溶液，將樣品溶液分別置于比色皿中，利用紫外可見分光光度計(jì)采集樣本光譜，掃描波長(zhǎng)范圍為200～600 nm。每個(gè)樣品采集1次，掃描次數(shù)1次。上述8種花生殼提取實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)取平均值。

為了確定好的分離條件，分別考查甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.5%磷酸、甲醇-0.5%磷酸溶液的流動(dòng)相對(duì)色譜分析結(jié)果的影響，從而最終確定實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相。

1.5 方法學(xué)考查

1.5.1 精密度實(shí)驗(yàn)

取S6樣品供試液，連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰值最高的3個(gè)峰為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，以考查實(shí)驗(yàn)方法的精密度。

1.5.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取S6樣品供試液，在1.3節(jié)色譜條件下分別在0、2、4、6、8 h下進(jìn)行含量測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算峰面積測(cè)定結(jié)果的RSD，以考查實(shí)驗(yàn)方法的穩(wěn)定性能。

1.5.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取S6樣品供試液，按供試品制備方法平行制備6份供試品溶液，在1.3節(jié)色譜條件下測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算測(cè)定結(jié)果的RSD，以考查實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性能。

1.6 指紋圖譜的數(shù)據(jù)處理

1.6.1 相似度分析

分別將8種花生殼樣品的色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004年A版)軟件里，以生成的特征指紋圖譜共有模式為對(duì)照，計(jì)算各樣品的相似度，考查色譜峰的一致性。

1.6.2 系統(tǒng)聚類分析

系統(tǒng)聚類分析能夠揭示樣品間的關(guān)系，繼而對(duì)樣品進(jìn)行分類，能提供的圖譜信息較多，可作為中藥指紋圖譜應(yīng)用于質(zhì)量控制的補(bǔ)充，這將在中藥材質(zhì)量控制及綜合評(píng)價(jià)分析中發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，以相對(duì)峰面積為變量，對(duì)8個(gè)產(chǎn)地不同品種的花生殼做聚類譜系圖，進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的確定

2.1.1 提取溶劑

在乙醇、甲醇、乙腈3個(gè)溶劑的色譜分析結(jié)果中，以甲醇提取的色譜峰數(shù)目最多，效果較好，所以實(shí)驗(yàn)采用甲醇為提取溶劑。

2.1.2 色譜流動(dòng)相確定

在以甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.5%磷酸、甲醇-0.5%磷酸溶液為流動(dòng)相的色譜分析比較實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.5%磷酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，各峰分離效果較好，色譜峰形較好，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)得出較為理想的梯度洗脫條件，故選擇乙腈-0.5%磷酸溶液作為實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相。

2.1.3 色譜分析的波長(zhǎng)

本實(shí)驗(yàn)用紫外分光光度計(jì)采集樣本光譜，見圖1。由圖1可知，8種樣品溶液在200～404 nm有較強(qiáng)的吸收，在230和290 nm處吸收峰較高，但由于230 nm處波長(zhǎng)較短，溶劑效應(yīng)較強(qiáng)。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，波長(zhǎng)為290 nm時(shí)色譜峰的數(shù)目最多，所以實(shí)驗(yàn)采用的色譜分析波長(zhǎng)為290 nm。

2.2 花生殼指紋圖譜的建立

對(duì)8種花生殼進(jìn)行記錄，測(cè)定色譜圖，并利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A對(duì)8種花生殼樣品的圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，設(shè)置S2為參照指紋圖譜，采用多點(diǎn)校正后進(jìn)行匹配，建立8種花生殼的HPLC共有模式圖，結(jié)果見圖2和圖3。由圖2可見，8種花生殼指紋圖譜共有14個(gè)共有峰。8種花生殼的供試品圖譜與對(duì)照指紋圖譜相似度依次為0.761、0.940、0.909、0.987、0.989、0.992、0.989、0.931，說(shuō)明8個(gè)品種的花生殼總體上相似度較高，只有新昌小京生花生殼(S1)相似度稍低。

2.3 系統(tǒng)聚類分析

以8種花生殼指紋圖譜的14個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積(表2)為變量，用SPSS 20.0數(shù)據(jù)系統(tǒng)分析軟件對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，選用組間聯(lián)接聚類方法，采用歐式距離度量標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算樣品的相似性程度，聚類結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，8種花生殼可分為兩大類：紹興新昌小京生、嵊州小紅毛、云南七彩、江蘇大白鯊花生殼(S1、S2、S3、S8)為一類，江蘇魯花十一號(hào)、山東黑玉珍、山東平度富硒黑皮、山東改良海花一號(hào)花生殼(S4、S5、S6、S7)為另一類。前一類在地域上并無(wú)明顯一致性，但這類花生大多較為瘦小，殼薄質(zhì)輕，另一類除魯花十一號(hào)以外均產(chǎn)自山東，并且這類花生較為粗大，果實(shí)飽滿。

圖1 樣品紫外光譜掃描圖Fig.1 UV spectrogram of sample

圖2 八種樣品HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of 8 samples

圖3 花生殼對(duì)照指紋圖Fig.3 Peanut shell contrast fingerprints

表2 共有峰的相對(duì)峰面積

1～14號(hào)峰的保留時(shí)間依次為1.5，2.4，4.5，5.2，5.5，6.1，6.9，9.6，13.4，14.5，19.9，25.5，26.0，36.6 min。

The retention time of Peak 1-14 were 1.5，2.4，4.5，5.2，5.5，6.1，6.9，9.6，13.4，14.5，19.9，25.5，26.0，36.6 min, respectively.

圖4 8種花生殼的聚類樹Fig.4 Cluster tree of 8 kinds of peanut shells

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.4.1 精密度

在實(shí)驗(yàn)條件下按精密度實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)方法測(cè)定樣品S6的色譜峰，以峰值最高的3個(gè)峰為參照峰，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，該方法具有良好的精密度與準(zhǔn)確度。

2.4.2 穩(wěn)定性

取S6樣品供試液，在1.3節(jié)色譜條件下分別在0、2、4、6、8 h下進(jìn)行含量測(cè)定，記錄相對(duì)峰面積，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，該方法具有良好的穩(wěn)定性。

2.4.3 重復(fù)性

取S6樣品供試液，按供試品制備方法平行制備6份供試品溶液，在1.3節(jié)色譜條件下測(cè)定，記錄相對(duì)峰面積，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，該方法具有良好的重復(fù)性。

表3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)HPLC得出8個(gè)產(chǎn)地不同品種的花生殼的色譜圖，建立了測(cè)定的色譜條件，并且對(duì)8種花生殼進(jìn)行指紋圖譜研究，用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，通過(guò)相似度、系統(tǒng)聚類分析方法，對(duì)不同品種進(jìn)行鑒別研究。結(jié)果表明，8個(gè)品種主要分為2大類：紹興新昌小京生、嵊州小紅毛、云南七彩、江蘇大白鯊花生殼為一類；江蘇魯花十一號(hào)、山東黑玉珍、山東平度富硒黑皮、山東改良海花一號(hào)花生殼為另一類。該HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法簡(jiǎn)便快捷，重現(xiàn)性好，可用于花生的質(zhì)量控制，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)不同品種花生的初步鑒定。