■袁春營 孟 陽 畢建才 崔青曼

（天津市海洋環(huán)境保護與修復技術工程中心天津市海洋資源與化學重點實驗室天津科技大學海洋與環(huán)境學院，天津300457）

南美白對蝦學名凡納濱對蝦，生長速度快、營養(yǎng)價值高、投報率高，是我國重要的養(yǎng)殖品種之一。但是隨著南美白對蝦養(yǎng)殖的迅猛發(fā)展，病害問題日益突出，日漸污染的環(huán)境，同樣威脅著養(yǎng)殖對蝦的安全，抗生素的使用，不但擾亂了對蝦消化道的正常菌群，使病原菌產生抗藥性，藥物在環(huán)境和對蝦體內的殘留最終威脅人類的健康與安全，已引起人們的廣泛關注[1]，一些學者將活的微生物添加到飼料中，通過改善腸道菌群平衡，而對動物產生有益影響[2-3]。但是，南美白對蝦飼料加工過程中有高溫熟化的過程，意味著添加的益生菌為抗高溫的芽孢桿菌，而對蝦的消化道短，大部分芽孢桿菌的芽孢經過對蝦腸道時未來得及萌發(fā)就排除體外，致使其應用效果受到限制。對此，開發(fā)高效益生菌投喂技術，提高益生菌的養(yǎng)殖效果具有重要實踐意義。

發(fā)酵飼料是以微生物為生物飼料發(fā)酵菌種，將飼料蛋白質轉化為微生物菌體蛋白、生物活性小肽類氨基酸、微生物活性益生菌為一體的生物發(fā)酵飼料，同時還可以去除飼料中的抗營養(yǎng)因子，在畜禽養(yǎng)殖上廣泛應用。鑒于此，我們通過將復合益生菌與飼料混合發(fā)酵，探討發(fā)酵飼料對南美白對蝦生長、消化酶活性和腸道菌群的影響，為發(fā)酵飼料的廣泛應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 對蝦和菌種

南美白對蝦來自天津鑫永豐水產養(yǎng)殖有限公司，規(guī)格(4.16±0.56)g，產朊假絲酵母菌、植物乳桿菌和地衣芽孢桿菌購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 實驗儀器

立式雙層小容量恒溫培養(yǎng)搖床，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；全溫型多振幅軌道搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；立式蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；PCR擴增儀，美國伯樂公司；高速冷凍離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司；生物顯微鏡，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；精密pH計，天津市盛邦科學儀器技術公司；CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；電子分析天平，梅特勒-托利多公司（瑞士）。

1.1.3 基礎飼料

基礎飼料為自行配制，配方見表1。飼料原料經粉碎后過80目篩，各原料按配比定量后混合均勻，然后加入適量的水揉勻，經雙螺桿擠條機擠壓出直徑為1.0 mm粒徑的飼料，60℃烘干后剪切成1.2 mm長的顆粒貯存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎飼料配方

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設計

本實驗設置1個發(fā)酵飼料組和1個對照組，每組設3個平行，共計6個處理。水族箱規(guī)格720 mm×490 mm×380 mm，每個水族箱中投放40只對蝦。

1.2.2 發(fā)酵飼料制備

將地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌和產朊假絲酵母分別擴大培養(yǎng)，細菌數(shù)量分別為1.2×109、1.5×109cfu/ml和1.6×109cfu/ml，然后按照體積比1∶1∶1混合，混合菌液中加入紅糖（2 g/1 000 ml）和自來水，菌種液與水的比例為1∶80，混合均勻，與對蝦飼料，按照2∶5的比例攪拌均勻，塑料薄膜密封發(fā)酵24 h，制成發(fā)酵飼料。

1.2.3 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)期間，投餌量按照對蝦體重的4%～6%進行投喂，每天投喂4次，投喂時間：6:00、11:00、16:00和21:00，各時間點投喂量占日總投餌量的比值分別為30%、20%、30%和20%。飼養(yǎng)期間連續(xù)充氣，水溫27～29 ℃，鹽度18～20，pH值7.8～8.1，溶解氧＞6 mg/l。飼養(yǎng)時間為6周。

1.2.4 指標測定

1.2.4.1 對蝦生物學指標

6周養(yǎng)殖結束，分別測定對蝦的體長和體質量，計算對蝦的特定生長率。

特定生長率(%/d，SGR)=100×（LnMt-LnMo）/t

式中：Mo和Mt——分別為初始體質量和終末體質量(g);

t——試驗天數(shù)(d)。

1.2.4.2 消化酶活性

①樣品處理

解剖南美白對蝦，取出胃、肝胰腺和腸道，去除腸道的內容物并且在濾紙上將表面的水分吸干，所有操作均在冰浴中進行。分別稱取適量腸道、胃及肝胰腺樣品，加入9倍體積預冷的生理鹽水勻漿，8 000 r/min、4℃離心10 min，取上清液，4℃?zhèn)溆谩?/p>

②胃蛋白酶

1.0%牛血紅蛋白-0.1 mol/l檸檬酸緩沖液（pH值3.0）1 ml，0.04 mol/l EDTA-Na20.05 ml，0.2 mol/l檸檬酸緩沖液（pH值3.0）0.2 ml，酶粗提液0.1 ml，置于37℃水浴中，反應15 min后加入30%三氯乙酸0.5 ml(空白在加入三氯乙酸后再加入酶粗提液)，8 000 r/min離心4 min，取上清液1 ml，加入0.5 mol/l NaOH 2.5 ml，F(xiàn)olin試劑0.25 ml，混勻，37℃水浴顯色15 min。680 nm波長測吸光值。胃蛋白酶活性用活力單位（U）表示，以1 mg蛋白的酶液每分鐘水解牛血紅蛋白產生1 μg酪氨酸為1個酶活力單位。

③蛋白酶

2%干酪素-0.1 mol/l磷酸鹽緩沖液（pH值7.2）1 ml，酶粗提液1 ml，置于37℃水浴中，反應15 min后加入30%三氯乙酸0.5 ml(空白在加入三氯乙酸后再加入酶粗提液)，8 000 r/min離心4 min，取上清液 1 ml，加入 0.4 mol/l Na2CO35 ml，稀釋的 Folin 試劑（與蒸餾水1∶1稀釋）1 ml，混勻，37℃水浴顯色15 min。680 nm波長測吸光值。蛋白酶活性用活力單位（U）表示，以1 mg蛋白的酶液每分鐘水解干酪素產生1 μg酪氨酸為1個酶活力單位。

④淀粉酶

1 ml 1.0%可溶性淀粉-0.1 mol/l磷酸鹽緩沖液（pH值8.0），加酶粗提液0.1 ml，37℃水浴反應5 min，加入DNS（3，5-二硝基水楊酸）顯色劑1.0 ml（空白在加入DNS后再加入酶粗提液），煮沸10 min終止反應，540 nm波長測吸光值。淀粉酶活性用活力單位（U）表示，以1 mg蛋白的酶液每分鐘水解淀粉產生1 mg葡萄糖為1個酶活力單位。

⑤脂肪酶

5 ml 0.025 mol/l磷酸緩沖液（pH值7.5）加入4 ml聚乙烯醇橄欖油乳化液，置40℃水浴中預熱10 min，然后加入酶粗提液0.5 ml，40℃保溫30 min，立即加入95%乙醇15 ml終止反應。加酚酞指示劑3滴，用0.05 mol/l標準NaOH滴定至微紅色，并同時做空白對照。脂肪酶活性用活力單位（U）表示，以1 mg蛋白的酶液每分鐘催化脂肪產生1 μmol脂肪酸為1個酶活力單位。

1.2.5 腸道菌群分析

解剖取出對蝦腸道，無菌水清洗，-20℃保存，送至北京諾禾致源科技股份有限公司測序。根據所擴增的16S區(qū)域特點，基于Illumina HiSeq測序平臺，利用雙末端測序（Paired-End）的方法，構建小片段文庫進行雙末端測序。對Reads拼接過濾，得到有效數(shù)據(Clean Data)，對 OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類，進行物種豐度、α-多樣性計算，挖掘不同處理組之間的差異。

1.2.6 數(shù)據處理與分析

各處理組數(shù)據進行單因素方差分析。分析軟件為SPSS 17.0，實驗數(shù)據均以“平均值±標準差（Mean±SD）”表示

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵飼料對南美白對蝦特定生長率的影響（見圖1）

圖1 發(fā)酵飼料對南美白對蝦生長性能的影響

發(fā)酵飼料投喂的南美白對蝦特定生長率高于對照飼料，但未達顯著性水平（P＞0.05），可見飼料經過發(fā)酵后，能夠提高南美白對蝦生長性能。

2.2 發(fā)酵飼料對南美白對蝦消化酶活性的影響

不同處理組南美白對蝦胃、肝胰腺和腸道的消化酶活性測定結果見表1、表2、表3、表4。發(fā)酵飼料能夠顯著或極顯著提高南美白對蝦胃、肝胰腺和腸道中胃蛋白酶活性（P＜0.05或P＜0.01），極顯著提高南美白對蝦腸道中蛋白酶活性（P＜0.01），顯著或極顯著提高南美白對蝦肝胰腺及腸道中淀粉酶活性（P＜0.05或P＜0.01），顯著提高南美白對蝦肝胰腺和腸道中脂肪酶活性(P＜0.05)，提高其他組織器官中消化酶活性，但未達顯著性差異（P＞0.05）。

表1 不同處理組南美白對蝦胃蛋白酶活性比較(U/mg)

表2 不同處理組南美白對蝦蛋白酶活性比較(U/mg)

表3 不同處理組南美白對蝦淀粉酶活性比較(U/mg)

表4 不同處理組南美白對蝦脂肪酶活性比較(U/mg)

2.3 發(fā)酵飼料對南美白對蝦腸道菌群的影響

基于Illumina HiSeq測序平臺，不同處理組南美白對蝦腸道菌群分析結果見圖2、圖3及表5，其中對照組用Control表示，發(fā)酵飼料組用FD表示。

圖2 南美白對蝦腸道菌群中的OTUs聚類和注釋情況

圖3 南美白對蝦腸道中門水平上的物種相對豐度柱形圖

表5 南美白對蝦腸道中α-多樣性指數(shù)統(tǒng)計

2.3.1 OTU聚類及物種注釋情況

對發(fā)酵飼料組和對照組南美白對蝦腸道中的OTU聚類和注釋結果進行了綜合統(tǒng)計，結果見圖2。發(fā)酵飼料組南美白對蝦腸道共得到86 176條Tags，1 470個OTUs，對照組為82 084條Tags，1 090個OTUs，可見飼喂發(fā)酵飼料后，腸道菌群種類數(shù)明顯增加。

2.3.2 物種相對豐度展示

根據物種注釋結果，選取每個樣品在各分類水平（Phylum、Class、Order、Family、Genus）上最大豐度排名前10的物種，生成物種相對豐度柱形累加圖，以便直觀查看各樣品在不同分類水平上，相對豐度較高的物種及其比例。以門水平物種相對豐度柱形圖為例展示如圖3。對每個樣品的物種分類結果，篩選特別關注的物種（默認選擇最大相對豐度前10的屬）進行物種分類樹統(tǒng)計。與對照組相比，發(fā)酵飼料組南美白對蝦腸道中的軟壁菌門（Tenericutes）相對豐度（Rela?tive Abundance）明顯增多（58.133%增加到70.04%），擬桿菌門（Bacteroidetes）相對豐度增加（2.251%增加到 2.71%），放線菌門（Actinobacteria）明顯增多（0.375%增加到0.45%），變形菌門（Proteobacteria）明顯減少（24.10%減小到20.002%），厚壁菌門明顯減?。ㄓ?.69%減小到2.236%），疣微菌門（Verrucomicro?bia）明顯減少，酸桿菌門（Acidobacteria）明顯增多。盡管發(fā)酵飼料組對蝦腸道中厚壁菌門相對豐度減?。ㄓ?.69%減小到2.236%），但是芽孢桿菌綱相對豐度增加（由1.147%增加到1.38%），乳桿菌屬相對豐度增加（由1.147%增加到1.38%），其中植物乳桿菌由0.001%增加到0.01%?？梢姲l(fā)酵飼料能夠改變對蝦腸道菌群組成，尤其提高了植物乳桿菌的相對豐度。

2.3.3 α-多樣性指數(shù)

一般來說，在97%以上的序列一致性下聚類成為一個OTU的序列被認為可能是源自于同一個種的序列。因此，對不同樣品在97%一致性閾值下的α-多樣性分析指數(shù)進行統(tǒng)計，見表5。發(fā)酵飼料組的南美白對蝦腸道菌群的香濃-威納指數(shù)、辛普森指數(shù)、chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、測序深度指數(shù)、譜系多樣性指數(shù)均明顯高于對照組，進一步說明發(fā)酵飼料投喂的對蝦腸道菌群多樣性較好。

3 討論

3.1 南美白對蝦的消化酶

甲殼動物消化酶的活性與其食性、發(fā)育階段、營養(yǎng)、溫度、pH值、鹽度等諸因素密切相關，并同時受到內因和外因的調控。對甲殼動物消化酶學的深入理解，有助于了解甲殼動物消化生理狀況，有效提高飼料的消化利用率，減輕對環(huán)境的污染[4]。黃凱等[5]研究了鹽度（1、15和30）對凡納濱對蝦幼蝦消化酶活性的影響，指出當鹽度為1時，胃腸中的胰蛋白酶、胃蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶及肝胰腺中的胃蛋白酶活性最高，各鹽度組的肝胰腺淀粉酶活性很接近；鹽度顯著影響凡納濱對蝦肝胰腺中胃蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活力，隨著鹽度增加，消化酶活力均不斷下降[6]。劉明等[7]研究后指出，0.3%、0.5%和1.0%酵母培養(yǎng)物顯著提高南美白對蝦肝胰腺蛋白酶活性；南美白對蝦胃、肝胰臟和腸道脂肪酶的最適溫度分別為50、30、40℃，淀粉酶的最適溫度均為30℃，蛋白酶的最適pH值分別為6.0、6.0、7.5，脂肪酶的最適pH值均為7.0，淀粉酶的最適pH值分別為6.0、7.0、6.5[8]。南美白對蝦胃蛋白酶和類胰蛋白酶活力從Z1到M3期逐漸增大，淀粉酶和纖維素酶活力呈逐漸下降趨勢，脂肪酶活力很低，在食性轉化過程中，胃蛋白酶、胰蛋白酶和淀粉酶活力呈現(xiàn)較明顯的變化，南美白對蝦幼體消化酶對餌料中的營養(yǎng)物質有著明顯的適應性[9]。乳酸菌能夠顯著提高凡納濱對蝦肝胰腺和腸道中的淀粉酶和脂肪酶活力及腸道中的蛋白酶活力[3]。我們經過研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵飼料能夠顯著提高南美白對蝦胃、肝胰腺和腸道中胃蛋白酶活性，顯著提高對蝦腸道中的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性及肝胰腺中的淀粉酶和脂肪酶活性。

3.2 南美白對蝦的腸道菌群

沙玉杰[3]采用Illumina Miseq高通量測序技術分析了凡納濱對蝦腸道中的細菌組成，發(fā)現(xiàn)變形菌、疣微菌和放線菌是各個處理組中的優(yōu)勢菌群，但各個處理組中均存在其特有的細菌種類，并且飼料中添加乳酸菌發(fā)酵上清液后，顯著增加了對蝦腸道中放線菌的豐度。以類芽孢桿菌和雙歧桿菌為益生菌，添加到凡納濱對蝦飼料中，明顯改善對蝦腸道的菌群組成[10]，芽孢桿菌和中草藥制劑也改變了凡納濱對蝦腸道菌群的數(shù)量與組成[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，軟壁菌、變形菌、擬桿菌和厚壁菌是對照組和發(fā)酵飼料組南美白對蝦腸道中的優(yōu)勢菌落，各個處理組中也存在其特有的細菌種類，發(fā)酵飼料能夠明顯增加軟壁菌、放線菌、酸桿菌和擬桿菌的豐度，尤其提高了植物乳桿菌的相對豐度?？梢?，飼料經過發(fā)酵后投喂對蝦，明顯改善了對蝦腸道的菌群組成。