■韓 偉徐 晶王大為

(1.國(guó)家糧食局科學(xué)研究院中心實(shí)驗(yàn)室，北京100037；2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，北京102206)

微生態(tài)制劑（Microbial ecological agent，MEA）,是從天然環(huán)境中篩選出來的有益微生物菌種、經(jīng)過培養(yǎng)后制成的活菌菌劑。廣義上的微生態(tài)制劑應(yīng)包括細(xì)菌、真菌、藻類及其代謝產(chǎn)物在內(nèi)，可改善動(dòng)物腸道環(huán)境和水體環(huán)境的微生態(tài)平衡，增強(qiáng)動(dòng)物的免疫防御能力，抑制病原菌生長(zhǎng)的生物制劑[1]。近年來，抗生素的過度使用與濫用，引發(fā)的藥物殘留和抗藥性問題越來越多，而微生態(tài)制劑作為一種新型的綠色飼料添加劑已成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)，向著加強(qiáng)應(yīng)用推廣、開發(fā)新型合理劑型、探索作用機(jī)制等方面發(fā)展[2-4]。

然而，微生態(tài)制劑（尤其是乳酸菌制劑）的應(yīng)用效果受多種因素影響，如動(dòng)物種類、生理狀態(tài)、制劑的菌種組成、劑量、加工工藝、飼喂方法、溫度和活菌制劑的保存時(shí)間等。所以，如何保證產(chǎn)品的穩(wěn)定性和使用效果，開發(fā)更具實(shí)用價(jià)值的微生態(tài)制劑劑型是亟需解決的關(guān)鍵問題和難點(diǎn)。很多研究表明，日糧添加和飲水補(bǔ)給方式向動(dòng)物補(bǔ)充益生菌，均能顯著影響機(jī)體生長(zhǎng)、代謝和免疫等。例如：短小芽孢桿菌（4D-14）制劑添加在肉雞日糧中，能有效降低養(yǎng)殖后期料重比并促使各段腸管隱窩變短，使上皮細(xì)胞成活率上升，并可替代阿維拉霉素[5]?？莶菅挎邨U菌、乳酪桿菌、異常漢遜酵母按2∶3∶2比例組成的制劑按0.5%～1.5%添加量加入仔豬日糧，腹瀉率和死亡率明顯降低，胃、空腸、結(jié)腸、盲腸中的乳酸菌數(shù)量顯著增加（P＜0.05），而使胃和盲腸中大腸桿菌數(shù)量顯著降低（P＜0.05），空腸、結(jié)腸、盲腸的腸壁厚度降低（P＜0.05），使空腸和盲腸的隱窩深度下降，而使結(jié)腸隱窩深度增加（P＜0.05）[6]。飲水中添加屎腸球菌或者輪換使用屎腸球菌和酸化劑對(duì)飲水量和采食量沒有負(fù)面影響[7]。胡須蛋種雞的日常飲水中按照500 g/t(每噸水添加試驗(yàn)品500 g)添加液態(tài)滅活乳酸菌制劑，在飲水中添加滅活乳酸菌制劑能夠促進(jìn)開產(chǎn)初期蛋雞的生產(chǎn)性能、改善機(jī)體健康，雞群產(chǎn)蛋率提高3.14%、合格蛋率提高2.11%，死淘率降低0.05%；經(jīng)濟(jì)效益方面的直接年只利提升達(dá)2.76元[8]。

本試驗(yàn)利用常見乳酸菌——屎腸球菌作為試驗(yàn)菌種，利用復(fù)合工藝制備微生態(tài)制劑，并添加于日糧和飲水，進(jìn)而飼喂斷奶仔豬，探討該制劑對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能和腸道健康的影響，為其在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

屎腸球菌Ef3-4：實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 種子及發(fā)酵培養(yǎng)基

白砂糖20 g，玉米漿干粉10 g，酵母浸膏5 g，MgSO4·7H2O 1.2 g，MnSO4·H2O 0.25 g，吐溫-80 0.5 ml，豆油0.05 g，1 000 ml蒸餾水，用1 mol/l NaOH調(diào)節(jié)pH值為7.0，115℃滅菌30 min。

1.1.3 ELISA試劑盒

購(gòu)自武漢默沙克生物科技有限公司。

1.1.4 藥品或試劑

海藻酸鈉、氯化鈣、檸檬酸、碳酸氫鈉、水溶性淀粉、白砂糖、玉米漿干粉、酵母浸膏、豆油為食品級(jí)，其余藥品或試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 微生態(tài)制劑的制備

①發(fā)酵液取得：取斜面菌種一環(huán)接于種子培養(yǎng)基搖瓶中，37℃、150 r/min搖床培養(yǎng)8 h后，按0.5%比例轉(zhuǎn)接至另一同樣液體培養(yǎng)基搖瓶中，37℃、180 r/min搖床培養(yǎng)8 h，再按1.5%比例轉(zhuǎn)接至（不通氧）發(fā)酵罐，37℃、80 r/min培養(yǎng)12 h，得到發(fā)酵液。發(fā)酵液經(jīng)管式離心（15 000 r/min，30 min）實(shí)現(xiàn)固液分離，其中的固體部分即為菌泥沉淀。②微囊化顆粒制備，方法見參考Han W等[9]；微囊化顆粒粒徑≤3.35 mm。③泡騰顆粒制備：a.配方：菌泥1 kg，檸檬酸4 kg，碳酸氫鈉3 kg，水溶性淀粉2 kg，蔗糖300 g，VC 20 g，甘油200 g，脫脂奶粉50 g。b.制法：將蔗糖、VC、甘油、脫脂奶粉先與微生物菌泥混合，凍干制菌粉；菌粉與檸檬酸、碳酸氫鈉及水溶性淀粉均勻混合，干法制粒，備用；泡騰顆粒粒徑≤2.36 mm。

1.2.2 成分與性質(zhì)檢測(cè)

活菌數(shù)檢測(cè)，參照GB/T 4789.2—2010方法；微囊化顆?？鼓嫘詸z驗(yàn)，方法見王婷婷[10]；泡騰顆粒性質(zhì)檢驗(yàn)，方法見參考宋怡敏[11]、杜小英[12]。

1.2.3 動(dòng)物試驗(yàn)

試驗(yàn)動(dòng)物：選用體重基本一致的35日齡健康仔豬150頭，按性別和體重相近原則隨機(jī)分成3個(gè)處理，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭，每個(gè)重復(fù)單舍飼養(yǎng)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)：處理1：抗生素組，日糧中添加抗生素(金霉素75 mg/kg)；處理2：益生菌組，日糧中添加0.1%的屎腸球菌Ef3-4發(fā)酵液（最終活菌數(shù)2×106CFU/g飼料）；處理3：微生態(tài)制劑組，日糧中添加0.1%的微囊化顆粒并在飲水中添加0.1%的泡騰顆粒。樣品與數(shù)據(jù)收集：留取0、18 d和36 d糞便和血清樣品，備用；同時(shí)，分別記錄仔豬初重和36 d的飼料消耗量與體重，觀察并統(tǒng)計(jì)仔豬腹瀉狀況。

1.2.4 腸道菌群多樣性分析

使用DNA提取試劑盒（Omega Bio-tek Inc.,Nor?cross,GA,USA）提取糞便中細(xì)菌DNA，并PCR擴(kuò)增其V3～V4 區(qū) 共 467 bp 的 片 段 。 引 物 ：338F，5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)-3’；806R，5’-GGAC?TACHVGGGTWTCTAAT-3’。PCR 體系：20 μl，4 μl的5×FastPfu Buffer，2 μl的2.5 mmol/l dNTPs，1.6 μl引物(5 μmol/l)，0.4 μl的 FastPfu 聚合酶及無菌超純水。PCR產(chǎn)物送至北京微生太科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序（Illumina Miseq平臺(tái)）。測(cè)序和分析方法參照參考文獻(xiàn)[13-18]。

1.2.5 免疫性能分析

使用1.1中所述ELISA試劑盒，分析0、18 d仔豬血清樣品中的Ig A、Ig G、Ig M、HSP-40。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“Mean±SD”表示，SPSS16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合及方差檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生態(tài)制劑成分與性質(zhì)分析

通過微囊化工藝和泡騰工藝，分別制成微囊化顆粒和泡騰顆粒，并且在仔豬日糧和飲水中同時(shí)使用。該微生態(tài)制劑的成分與性質(zhì)分析見表1。

由表1可見，微囊化顆粒的活菌數(shù)為1.0×1011CFU/g，在80℃高溫和模擬胃液中活菌存活率分別達(dá)到85.0%和90.0%，表現(xiàn)出良好的抗逆屬性。泡騰顆粒的活菌數(shù)為1.0×1010CFU/g，每5 g的發(fā)泡量和崩解時(shí)限分別為6.5 ml和5 min，崩解后pH值約為6.2，不但可以在短時(shí)間內(nèi)溶解，而且對(duì)飲水的酸堿度影響小。此外，泡騰顆粒加入形式優(yōu)于益生菌發(fā)酵液直接摻入飲水，原因在于發(fā)酵液中殘留可溶糖、蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽，同時(shí)改變飲水pH值，增加不確定因素且易于飲水傳遞；泡騰顆粒的優(yōu)點(diǎn)還在于，易于飲水傳遞、避免堵塞飲水濾網(wǎng)，增加益生菌存活。

表1 微生態(tài)制劑的成分與性質(zhì)分析

2.2 微生態(tài)制劑對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響

微生態(tài)制劑按0.1%的添加量加入斷奶仔豬的日糧和飲水系統(tǒng)，仔豬生長(zhǎng)性能的結(jié)果見表2。

表2 添加微生態(tài)制劑對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響

由表2可見，在飼養(yǎng)周期內(nèi)，微生態(tài)制劑組與抗生素組相比，平均日增重和料重比無明顯差異（P＞0.05）。微生態(tài)制劑組與益生菌組相比，平均日增重?zé)o顯著差異（P＞0.05），而料重比顯著降低3.7%（P＜0.05）。

2.3 微生態(tài)制劑對(duì)仔豬腹瀉率和死亡率的影響(見表3)

表3 添加微生態(tài)制劑對(duì)仔豬腹瀉和死亡率的影響

由表3可見，在飼養(yǎng)周期內(nèi)，微生態(tài)制劑組與益生菌組、抗生素組相比，腹瀉率分別顯著降低6.6%(P＜0.05)和13.1%(P＜0.05)。

2.4 微生態(tài)制劑對(duì)仔豬腸道菌群的影響

3個(gè)飼喂處理組在不同生長(zhǎng)時(shí)間點(diǎn)的糞便被收集，利用針對(duì)16S rRNA基因的高通量測(cè)序技術(shù)，其中菌群的高分辨信息（包括定性與豐度數(shù)據(jù)）被分析，見圖1～圖3。

圖1 組間物種差異顯著性檢驗(yàn)(門水平)

由圖1可見，在“門”分類水平上，微生態(tài)制劑組與益生菌組、抗生素組相比，厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、無壁菌門（Tenericutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）等代表著樣品中大多數(shù)菌群，占比95%以上。同時(shí)，不同組間各物種的豐度發(fā)生了明顯的變化。與后兩者相比，微生態(tài)制劑組中無壁菌門菌群顯著地降低(P＜0.05)。

由圖2和圖3可見，在“屬”分類水平上，無論抗生素組、益生菌組和微生態(tài)制劑組，隨時(shí)間變化仔豬菌群結(jié)構(gòu)也在發(fā)生著改變。0～35 d，巨型菌屬（Megasphaera）、鏈型桿菌屬（Catenibacterium）、葡萄球菌屬（Streptococcus）等菌群相對(duì)豐度隨時(shí)間變化顯著(P＜0.05)。而乳桿菌屬（Lactobacillus）作為優(yōu)勢(shì)菌群且相對(duì)豐度變化不大，微生態(tài)制劑組與益生菌組、抗生素組相比，乳桿菌屬的相對(duì)豐度有增加趨勢(shì)。

2.5 微生態(tài)制劑對(duì)仔豬免疫性能的影響

利用酶聯(lián)免疫法分析，檢測(cè)微生態(tài)制劑對(duì)仔豬血清中熱休克蛋白-40（HSP-40）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）等的影響，結(jié)果見表4。

由表4可見，18 d時(shí)，與抗生素組相比，添加微生態(tài)制劑喂養(yǎng)的仔豬血清中IgA和IgM水平均有顯著性提高(P＜0.05)。而與益生菌組相比，添加微生態(tài)制劑喂養(yǎng)的仔豬血清中HSP-40水平顯著提高(P＜0.05)，IgA和IgM水平無顯著性改變(P＞0.05)，IgG水平顯著降低(P＜0.05)。

3 討論

圖2 組間物種差異顯著性檢驗(yàn)(屬水平)

隨著人們生活質(zhì)量的提高以及全球經(jīng)濟(jì)一體化，動(dòng)物性食品安全已成為一個(gè)世界性的挑戰(zhàn)和全球重要的公共衛(wèi)生問題。其中，抗生素殘留問題是影響動(dòng)物性食品安全的重要因素之一?；趯?duì)抗生素危害性的認(rèn)識(shí)，“安全、綠色、環(huán)?！钡男滦惋曈每股靥娲a(chǎn)品已成為飼料行業(yè)的重點(diǎn)發(fā)展方向。微生態(tài)制劑，作為純天然綠色產(chǎn)品，符合當(dāng)今健康養(yǎng)殖模式，迎合人們追求綠色食品的意愿，其推廣應(yīng)用給飼料行業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)效益，對(duì)促進(jìn)都市型現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

我國(guó)農(nóng)業(yè)部第1126號(hào)公告公布的允許使用的飼料添加劑品種目錄（2008）中，飼料級(jí)微生物添加劑有16種，屎腸球菌（Enterococcus Faecium）、糞腸球菌（Enterococcus Faecilius）和乳酸腸球菌（Lactococcus lactis）也都包括在內(nèi)。屎腸球菌，是人體內(nèi)原著菌群、同樣是飼料工業(yè)中廣泛使用的乳酸菌菌種之一；其自身的優(yōu)良性能在飼料添加劑中得以體現(xiàn)：大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，飼料中加入屎腸球菌，具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、調(diào)整腸道菌群結(jié)構(gòu)、抑制有害病原菌生長(zhǎng)、減少疾病發(fā)生、降低仔豬腹瀉率、改善毛色光澤、減少糞臭等優(yōu)良特性。與此同時(shí)，屎腸球菌類產(chǎn)品也存在著其它乳酸菌類似的問題，如菌株的純化與傳代、存儲(chǔ)過程中抗逆性差、貨架期短、檢測(cè)方法不統(tǒng)一，導(dǎo)致產(chǎn)品穩(wěn)定性和益生特性差異大[9-10]。

微膠囊包被是一種用微型密封膠囊包被固態(tài)、液態(tài)或氣態(tài)物質(zhì)，在特定條件影響下以可控速度釋放包被內(nèi)容物的技術(shù)。微膠囊技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于形成微膠囊時(shí)，芯材被壁材包覆而與外界環(huán)境隔離，它的性質(zhì)能較好地保留下來，在適當(dāng)?shù)臈l件下，壁材被破壞時(shí)又能將囊心釋放出來。這給使用帶來許多方便:①將益生菌通過微囊化轉(zhuǎn)變成一種穩(wěn)定的細(xì)粉顆粒，改變微生態(tài)制劑產(chǎn)品的形態(tài)，這種微膠囊產(chǎn)品具有良好的流動(dòng)性和分散性，很容易與其它飼料混合均勻，便于運(yùn)輸、貯存和添加使用。②微生態(tài)制劑產(chǎn)品的耐酸性和熱穩(wěn)定性較差，但將其制成微膠囊產(chǎn)品后，由于微膠囊的保護(hù)，能夠有效地防止菌體失活，提高微生態(tài)制劑產(chǎn)品的穩(wěn)定性。采用腸溶性壁材后，還能防止胃液的破壞，從而使盡可能多的菌體到達(dá)腸道，真正起到保健和治療的作用。③可將配伍禁忌的各種成分在同一產(chǎn)品中隔開。④使不溶于水的物質(zhì)能均勻地分散在水溶性介質(zhì)中。因此，微膠囊化有望提高益生菌在生產(chǎn)、貯存和消費(fèi)過程中的穩(wěn)定性，生產(chǎn)出耐貯存、耐高溫、耐高壓、耐酸性的微生態(tài)制劑[19-22]。本研究涉及的微囊化顆粒的活菌數(shù)為1.0×1011CFU/g，在80℃高溫和模擬胃液中活菌存活率分別達(dá)到85.0%和90.0%。

圖3 腸道菌群組成（屬水平）分析

表4 免疫性能分析

泡騰技術(shù)系在制劑中加入碳酸鹽和有機(jī)酸、遇水產(chǎn)生CO2氣體而調(diào)節(jié)釋藥行為的技術(shù)；泡騰片即是依此技術(shù)原理制成的片劑。它具有攜帶使用方便、水中均勻分布、生物利用度高等特點(diǎn)，兼有固態(tài)制劑和液態(tài)制劑的優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于藥品、食品、保健品等領(lǐng)域，應(yīng)用前景廣闊[12]。益生菌與泡騰技術(shù)相結(jié)合，可制成適合飲水的片劑；不僅減少了液態(tài)益生菌制劑儲(chǔ)存要求高、品質(zhì)不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，還降低了某些固態(tài)益生菌制劑加工過程中活菌死亡的風(fēng)險(xiǎn)（如高溫高濕環(huán)境制粒）。本研究涉及的泡騰顆粒的活菌數(shù)為1.0×1010CFU/g，每5 g的發(fā)泡量和崩解時(shí)限分別為6.5 ml和5 min，崩解后pH值約為6.2，有利于在飼喂動(dòng)物飲水系統(tǒng)中釋放并達(dá)到合適的使用濃度。

本研究將兩種不同工藝運(yùn)用到益生菌產(chǎn)品的制備中，制成同時(shí)適合日糧與飲水添加的微生態(tài)制劑，分析了主要成分含量及性質(zhì)，再將該制劑按0.1%比例加入到仔豬日糧和飲水中。經(jīng)過36 d的飼養(yǎng)周期，與抗生素組相比，仔豬的平均日增重和料重比無明顯差異（P＞0.05），腹瀉率顯著降低13.1%(P＜0.05)；糞便中無壁菌門菌群顯著地降低(P＜0.05)，乳桿菌屬菌群豐度有增加趨勢(shì)。與抗生素組相比，添加微生態(tài)制劑喂養(yǎng)的仔豬血清中IgA和IgM水平均有顯著性提高(P＜0.05)。而與益生菌組相比，添加微生態(tài)制劑喂養(yǎng)的仔豬血清中HSP-40水平顯著提高(P＜0.05)，IgA和IgM水平無顯著性改變(P＞0.05)，IgG水平顯著降低(P＜0.05)。

4 結(jié)論

綜上結(jié)果可見，該微生態(tài)制劑可顯著提高仔豬的生長(zhǎng)性能、顯著降低仔豬腹瀉率，顯著影響了腸道菌群組成和部分免疫指標(biāo)。此外，有兩個(gè)問題需要今后深入研究和對(duì)比：①本研究中運(yùn)用了兩種工藝制成復(fù)合制劑，但由于條件有限、未對(duì)單一工藝產(chǎn)品做動(dòng)物對(duì)照試驗(yàn)，需要進(jìn)一步探索。②微生態(tài)制劑中只使用了一種乳酸菌，而使用其它種乳酸菌的劑量與功效，需要進(jìn)一步對(duì)比和試驗(yàn)。