■張學(xué)雯 孫鐿釗 劉 澤 王曉芳 李 牧 李紅亞 李術(shù)娜*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071001；2.保定市畜牧工作站，河北保定071051；3.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，河北保定071000；4.保定市動(dòng)物產(chǎn)品檢驗(yàn)監(jiān)測(cè)中心，河北保定071051）

玉米芯是玉米穗脫粒后的穗軸，是玉米的副產(chǎn)物，產(chǎn)量巨大，達(dá)每年4 000萬(wàn)噸[1-2]。玉米芯具有韌性好、組織均勻、硬度適宜等優(yōu)點(diǎn)，是一種良好的可回收利用的資源[3]。玉米芯含有粗蛋白質(zhì)2.42%、粗脂肪0.36%、粗纖維35.42%、鈣0.120 1%、磷0.039 9%、中性洗滌纖維79.13%、酸性洗滌纖維42.49%、酸性洗滌木質(zhì)素5.77%，無(wú)毒性且營(yíng)養(yǎng)豐富[4]。目前對(duì)玉米芯的應(yīng)用研究較少，只有極少部分用于糠醛及木糖醇等生產(chǎn)[5]。玉米芯的適口性較差，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不易消化吸收，致使其在畜牧業(yè)中應(yīng)用較少，大部分被直接燒掉，造成資源的極大浪費(fèi)同時(shí)造成環(huán)境污染[6]。因此，利用微生物制劑來(lái)提高玉米芯飼用價(jià)值的研究具有極其重要的意義。

在養(yǎng)殖業(yè)中，發(fā)酵飼料作為一種新型環(huán)保飼料，已成為當(dāng)今熱點(diǎn)研究方向。利用微生物產(chǎn)生的酶降解農(nóng)作物副產(chǎn)物中的大分子物質(zhì)及抗?fàn)I養(yǎng)因子，改善其消化性能，并提高其粗蛋白含量，同時(shí)積累豐富的維生素、礦物質(zhì)和其他生物活性物質(zhì)，既可有效提高農(nóng)副產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，提高抗病能力，減少疾病的發(fā)生，又可以部分地解決環(huán)境污染問(wèn)題[7-8]。已有大量研究證明將其添加于飼料中，可有效提高畜禽的生長(zhǎng)率[9-10]。

關(guān)于發(fā)酵菌劑的研究中，目前，由于單一微生物發(fā)酵具有局限性，發(fā)酵方式已從單一菌種的發(fā)酵趨向于復(fù)合菌株的協(xié)同發(fā)酵。此外，固態(tài)發(fā)酵本身成本低，可利用資源豐富，對(duì)環(huán)境污染小，現(xiàn)已成為能源開(kāi)發(fā)的新途徑[11-12]。本研究旨在研制適于玉米芯發(fā)酵的微生物菌劑，達(dá)到提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和抗病能力，提高飼料利用率，降低養(yǎng)殖成本的目的，為今后合理利用玉米芯提供科學(xué)的方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌源樣品

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院制藥工程系提供的550株產(chǎn)芽孢細(xì)菌。

1.1.2 培養(yǎng)基

纖維素酶鑒別培養(yǎng)基，木質(zhì)素酶系鑒別培養(yǎng)基，淀粉酶鑒別培養(yǎng)基，蛋白酶鑒別培養(yǎng)基，無(wú)機(jī)氮培養(yǎng)基，BM培養(yǎng)基，NB培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基[13]。復(fù)篩發(fā)酵培養(yǎng)基：大豆蛋白胨20.0 g，玉米粉20.0 g，Na2HPO42.0 g，NaH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl20.2 g，水1 000 ml，pH值7.0。

1.1.3 玉米芯粉

將供試的玉米芯機(jī)械粉碎為直徑約為1.5 mm。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物

肉兔：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)本園養(yǎng)殖基地購(gòu)買(mǎi)60只日齡為8周齡的肉兔并隨機(jī)分為5組。早中晚3次飼喂肉兔，保持水槽內(nèi)水量充足，干凈衛(wèi)生。預(yù)飼期3 d，飼喂期30 d。肉兔飼料：購(gòu)于河北省禽塔集團(tuán)。對(duì)照組：飼喂全價(jià)飼料。試驗(yàn)1～4組在全價(jià)飼料的基礎(chǔ)上分別添加10%、15%、20%、25%玉米芯發(fā)酵飼料?；A(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

1.2 玉米芯發(fā)酵功能菌株的分離

1.2.1 大腸桿菌拮抗菌株的篩選

將3 ml大腸桿菌菌液加入到冷卻至45℃左右的NA培養(yǎng)基中，搖勻，倒平板，制成病原菌指示平板。將供試菌株點(diǎn)接于該平板，37℃培養(yǎng)24 h后觀察并記錄抑菌圈的直徑大小。將具有較高抑菌活性的菌株挑選出來(lái)重新編號(hào)，進(jìn)行下一步研究。

1.2.2 產(chǎn)酶菌株的篩選

將供試菌株用畫(huà)十字的方法分別接種于纖維素酶、木質(zhì)素酶系（避光培養(yǎng)）、蛋白酶和淀粉酶的鑒別培養(yǎng)基的平板上，37℃恒溫培養(yǎng)，纖維素酶、木質(zhì)素酶系、蛋白酶的鑒別培養(yǎng)基平板每天觀察菌落周?chē)欠裼型该魅?；淀粉酶鑒別培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)2 d待長(zhǎng)出明顯菌落后，在平板上滴加碘液，觀察菌落周?chē)欠癯霈F(xiàn)的透明圈，記錄透明圈的直徑大小。挑選透明圈、變色圈較大的菌株進(jìn)行纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶[14]和木質(zhì)素酶系活力的測(cè)定[15]。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2.3 無(wú)機(jī)氮轉(zhuǎn)化利用菌株的篩選

將供試菌株種子液以5%接種量接種于無(wú)機(jī)氮培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)24 h，測(cè)定各菌株培養(yǎng)基的OD600值。

1.2.4 各功能菌株之間的拮抗性試驗(yàn)

將復(fù)篩得到功能菌株分別為指示菌，將其種子液接種于冷卻至45℃左右的NA培養(yǎng)基中，混勻后倒平板，待平板凝固后點(diǎn)接另外兩株細(xì)菌菌株，于37℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察各菌株周?chē)志Φ拇笮　?/p>

1.3 功能菌株的種屬鑒定

參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[16]的方法進(jìn)行菌體、菌落形態(tài)觀察及生理生化鑒定。依據(jù)文獻(xiàn)[17]進(jìn)行菌株DNA提取和16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建。

1.4 玉米芯的發(fā)酵效果考察

將篩選得到的3個(gè)功能菌株ZX-2、ZX-19、XW-7進(jìn)行菌液制備，然后按照生物量1∶3∶3的比例復(fù)配為復(fù)合菌劑對(duì)玉米芯進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，結(jié)束后測(cè)定玉米芯中粗蛋白、淀粉、粗脂肪、糖類(lèi)、粗纖維等營(yíng)養(yǎng)成分的含量變化來(lái)評(píng)判發(fā)酵效果。粗纖維、粗蛋白、淀粉、粗脂肪、及中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量測(cè)定分別依據(jù)GB/T 6434—2006、GB/T 20194—2006、GB/T 20194—2006、GB/T 6433—2006及Van Soest等[18-22]方法進(jìn)行。

1.5 肉兔飼喂效果

記錄肉兔始末的體重和給料量，計(jì)算肉兔平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）和料重比（F/G）。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，進(jìn)行多重比較。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。P＜0.05，表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 玉米芯發(fā)酵功能菌株的分離2.1.1 大腸桿菌拮抗菌株的分離

采用抑菌圈法，共篩選到對(duì)大腸桿菌抑菌活性較高的20株菌，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 菌株抑菌圈直徑大小

至此，從供篩選的菌株中，挑選出菌株ZX-2，具備拮抗大腸桿菌，轉(zhuǎn)化利用無(wú)機(jī)氮功能，纖維素酶活力為20.58 U/g，蛋白酶活力為58.36 U/g，淀粉酶活力為35.92 U/g；挑選出菌株ZX-9，具備拮抗大腸桿菌，轉(zhuǎn)化利用無(wú)機(jī)氮功能，產(chǎn)纖維素酶活力為26.74 U/g，木質(zhì)素酶系活力為48.92 U/g，蛋白酶活力為32.26 U/g；挑選出菌株XW-7，具備拮抗大腸桿菌，轉(zhuǎn)化利用無(wú)機(jī)氮功能，產(chǎn)纖維素酶活力為54.71 U/g，木質(zhì)素酶系活力為26.62 U/g，淀粉酶活力為29.61 U/g。將此3種菌株復(fù)配為復(fù)合菌劑，既可達(dá)到試驗(yàn)所設(shè)定的全部功能，因此，對(duì)此3株菌進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2 產(chǎn)酶菌株篩選

將篩選得到的大腸桿菌拮抗細(xì)菌在各種產(chǎn)酶鑒別培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，獲得了相應(yīng)地水解圈、變色圈菌株。對(duì)水解圈、變色圈較大菌株進(jìn)行液體發(fā)酵，其上清液進(jìn)行酶活力定量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.1.3 轉(zhuǎn)化利用無(wú)機(jī)氮菌株的篩選

通過(guò)對(duì)菌株進(jìn)行無(wú)機(jī)氮利用能力的測(cè)定，可以看出有些菌株能夠利用無(wú)機(jī)氮氮源轉(zhuǎn)化成本身菌體蛋白，即成為了有機(jī)氮形式。結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 復(fù)篩菌株的各種酶活力大?。║/g）

表4 菌株在無(wú)機(jī)氮培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況

2.1.4 功能菌株的鑒定

結(jié)合菌落和菌體形態(tài)、生理生化特征及16S rDNA序列分析，鑒定菌株ZX-2為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），菌株ZX-9為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），菌株XW-7為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。菌種的鑒定結(jié)果表明三菌株均屬于農(nóng)業(yè)部文件規(guī)定的飼用允許菌種，安全性以及生產(chǎn)特性良好，可以作為下一步試驗(yàn)的目標(biāo)菌株。

2.1.5 功能菌株之間拮抗性試驗(yàn)

采用抑菌圈法，測(cè)定各功能菌株之間的拮抗性，通過(guò)觀察透明圈的大小測(cè)定菌株間拮抗性的大小。結(jié)果表明三株功能菌株之間沒(méi)有明顯的拮抗性。

2.2 玉米芯發(fā)酵前后營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)比

以ZX-2∶ZX-9∶XW-7=1∶3∶3的接菌比例對(duì)玉米芯進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵后，其營(yíng)養(yǎng)成分含量較發(fā)酵前有了很大變化，表5可見(jiàn)，粗蛋白提高了115.8%，淀粉降低了34.4%，還原糖提高了91.7%，粗纖維降低了21.4%，中性洗滌纖維降低了18.8%，酸性洗滌纖維降低了22.5%。

表5 玉米芯發(fā)酵前后營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)比

2.3 肉兔飼喂效果研究

表6可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)1～4組日增重分別增長(zhǎng) 11.54%（P＜0.05）、17.91%（P＜0.01）、13.21%（P＜0.05）和0.57%（P＜0.05），料重比分別降低了6.21%（P＞0.05）、10.05%（P＜0.01）、8.02%（P＜0.05）和-1.31%（P＜0.05）。試驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)玉米芯添加量為15%時(shí)能使試驗(yàn)動(dòng)物生長(zhǎng)性能達(dá)到最佳。

表6 試兔生長(zhǎng)性能變化

3 討論

多項(xiàng)研究表明，可以通過(guò)微生物對(duì)玉米芯進(jìn)行降解，提高玉米芯飼用價(jià)值，從而使玉米芯獲得更有效的應(yīng)用。劉東波等[23]采用毛霉Sb-27、黑曲霉Sb-11固體培養(yǎng)所產(chǎn)生的纖維素酶和木聚糖酶對(duì)玉米芯進(jìn)行酶解，以提高其飼用價(jià)值。張飛偉等[5]利用熱帶假絲酵母發(fā)酵玉米芯水解液生產(chǎn)木糖醇，提高了玉米芯商業(yè)生產(chǎn)的潛力。

玉米芯是一種可開(kāi)發(fā)利用于草食家畜的非常規(guī)飼料資源。近幾年來(lái)，玉米芯的用途隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展正逐步由廢棄物拓展為家畜飼料。家畜對(duì)纖維飼料資源利用的研究已逐漸引起人們的關(guān)注，田剛等[24]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用玉米芯和菜籽粕混合物替代苜蓿草粉飼喂肉兔，證實(shí)了玉米芯的飼糧中添加一定水平的玉米芯和菜籽粕混合物不會(huì)對(duì)肉兔生長(zhǎng)性能和健康狀況造成明顯的負(fù)面影響。王利華[25]將玉米芯添加于肉牛日糧組合中，結(jié)果表明試驗(yàn)牛日增重提高29.48%，經(jīng)濟(jì)效益非?？捎^。石儉[13]將發(fā)酵玉米芯添加到獺兔和肉鴨飼糧中，結(jié)果表明，試驗(yàn)獺兔日增重提高9.13%，試驗(yàn)肉鴨日增重提高51.27%。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的玉米芯飼料由于其適口性好、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，可大大提高家兔對(duì)纖維飼料的利用率，對(duì)充分利用粗飼料資源將極具生產(chǎn)實(shí)踐意義。

4 結(jié)論

由試驗(yàn)結(jié)果可得，以ZX-2∶ZX-9∶XW-7=1∶3∶3的接菌比例對(duì)玉米芯進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵后，其營(yíng)養(yǎng)成分含量較發(fā)酵前有了很大提高，粗蛋白提高了115.8%，淀粉降低了34.4%，還原糖提高了91.7%，粗纖維降低了21.4%，中性洗滌纖維降低了18.8%，酸性洗滌纖維降低了22.5%。將發(fā)酵后的玉米芯以15%的添加量添加于兔日糧中，效果最好，試驗(yàn)2組比對(duì)照組的日增重增加了17.91%，料重比降低了10.05%。本試驗(yàn)將添加發(fā)酵菌劑的玉米芯飼料應(yīng)用于肉兔養(yǎng)殖中，可提高肉兔的生長(zhǎng)性能。