金 曉 李曉紅 賈森泉 胡凝珠 胡云章

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所 云南省蟲媒傳染病防控研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650118) (2.昆明醫(yī)科大學(xué)，昆明 650500)

疫苗是人類防控傳染性疾病最有效的手段，接種疫苗估計(jì)每年可避免超過250萬例死亡[1]，市場(chǎng)上投入使用的疫苗一般是由抗原和佐劑組成，免疫佐劑對(duì)于疫苗作用的發(fā)揮起著至關(guān)重要的作用。佐劑能夠迅速激活免疫系統(tǒng)，這對(duì)于免疫力低下的兒童和老人意義就顯得更加重要[2]。生物信息學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和反向遺傳學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，為未來新型疫苗的研發(fā)提供了新的方向和思路，新疫苗的迅速發(fā)展使佐劑安全性和疫苗免疫原性增強(qiáng)效應(yīng)受到關(guān)注[3]。目前已被批準(zhǔn)應(yīng)用于人類的佐劑，包括鋁鹽佐劑、MF59、AS03、AS04和脂質(zhì)體，但是一些局部皮膚炎癥反應(yīng)、IgE抗體反應(yīng)和安全性等問題仍不容忽視。因此開發(fā)新型高效、經(jīng)濟(jì)、無副作用的免疫佐劑是未來佐劑研發(fā)的核心任務(wù)[4-5]。

甘油-3-磷酸(Glycerol-3-phosphate，G3P)，是原核生物、植物、動(dòng)物和人類生長(zhǎng)過程中非常重要的物質(zhì)，并且是與疾病相關(guān)的重要代謝物，是人體糖酵解和脂肪代謝通路中重要的組成部分[6]。中鏈脂肪酸甘油三酯(MCT)在酯酶的作用下水解為游離脂肪酸和甘油，肝細(xì)胞攝取甘油并且在甘油激酶的作用下反應(yīng)生成甘油-3-磷酸。有證據(jù)表明中鏈脂肪酸甘油三酯(MCT)能夠增強(qiáng)免疫應(yīng)答和改變免疫應(yīng)答的類型[7-8]。目前沒有報(bào)道甘油-3-磷酸在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上是否有增強(qiáng)免疫應(yīng)答的作用，但是G3P是植物中廣譜抗原誘導(dǎo)劑的重要形式，稱為系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquired resistance,SAR)。原發(fā)感染引起SAR，并保護(hù)遠(yuǎn)端組織免受繼發(fā)感染，G3P生物合成缺陷的遺傳突變體不能誘導(dǎo)SAR，只有當(dāng)G3P外源供應(yīng)時(shí)才可重新誘導(dǎo)SAR，因此G3P就起到一個(gè)增強(qiáng)免疫應(yīng)答的作用[9-10]。有關(guān)證據(jù)表明，植物中的G3P水平與真菌病原菌希金斯炭疽菌(Colletotrichum higginsianum)的防御作用有關(guān)，G3P的增加可增強(qiáng)擬南芥抵御希金斯炭疽菌侵害的作用[11]。在藻類植物中也含有一些抗菌物質(zhì)的活性，并且他們?cè)趧?dòng)物身上也起到一個(gè)類似于植物的抗病毒的活性，有文獻(xiàn)報(bào)道，藻類中的海洋硫酸多糖911可增強(qiáng)機(jī)體免疫能力[12]。那么甘油-3-磷酸是否也像藻類植物中的多糖一樣不僅在植物中有免疫增強(qiáng)作用，而且在動(dòng)物的免疫應(yīng)答方面也能起到佐劑效應(yīng)呢，因此我們對(duì)其免疫佐劑效應(yīng)進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 疫苗

甲型肝炎減毒活疫苗，抗原滴度為18EU/mL，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR雌性小鼠49只、年齡為6～8周、體質(zhì)量約為18～22 g/只，SPF級(jí)，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(滇) K2014-0002]。

1.3 主要試劑

甘油-3-磷酸，又稱甘油磷酸酯，購(gòu)自J&K，CAS NO. 57-03-4；Al(OH)3佐劑由本實(shí)驗(yàn)室保存提供，濃度為12.5 mg/mL；抗HAV IgG ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自KPL公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與免疫

將ICR雌性小鼠分為7組，每組是7只，分別為HAV對(duì)照組，鋁佐劑對(duì)照組，陰性對(duì)照組(生理鹽水組)和四組不同劑量的甘油-3-磷酸組，按表1配比后混合，分別皮下免疫一次，每只300 μL。

表1 動(dòng)物分組

1.5 抗HAV IgG抗體水平檢測(cè)

在初次免疫以后的第4、第8、第12、第16、第20周，分別采小鼠尾部靜脈血100 μL左右，37 ℃靜置1 h，然后4 ℃靜置4 h，吸取上層血清備用。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA，enzyme-linked immunosorbent assay)檢測(cè)抗HAV IgG，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 甘油-3-磷酸的安全性觀察

在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)，觀察小鼠是否有異常反應(yīng)，例如掉毛、體質(zhì)量減輕、炎癥反應(yīng)等表現(xiàn)，觀察小鼠身體狀況。于免疫20周后，分別取甘油-3-磷酸2 mg組和陰性對(duì)照組小鼠心臟、肝臟、脾臟、腎臟和肺組織，依次經(jīng)甲醛固定、70% ～ 100%酒精脫水、浸蠟、包埋、切片、HE染色，在電鏡下觀察各組織的病理變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 甘油-3-磷酸的體液免疫效果

2.2 甘油-3-磷酸作為HAV抗原佐劑的安全性檢測(cè)

安全性檢測(cè)結(jié)果顯示,小鼠都沒有發(fā)生呼吸困難、掉毛、撓鼻、痙攣、休克等異常反應(yīng)；生活習(xí)性均正常。病理切片觀察發(fā)現(xiàn)甘油-3-磷酸2 mg小鼠與陰性對(duì)照組小鼠的肺、肝、心、脾、腎的組織切片一切正常，未發(fā)生異常組織變化，結(jié)果見圖2，表明在甘油-3-磷酸2 mg劑量組具有很好的安全性。

表2 不同組小鼠血清中抗HAV IgG抗體水平比較

注： 抗HAV IgG用lg表示。與單純抗原組比，*P<0. 05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：與鋁佐劑組比較，#P<0. 05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 Note: Anti-HAV IgG is showed with lg compared with antigen group，*P<0.05 is showed significant difference；compared with Al(OH)3group，#P<0.05 is showed significant difference

圖1 不同組別小鼠血清中抗HAV IgG抗體水平比較

圖2 甘油-3-磷酸2mg實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組的小鼠各臟器的病理學(xué)觀察(×10)

3 討論

疫苗是人類用來預(yù)防疾病的關(guān)鍵用品，要想疫苗發(fā)揮其最好的效果，佐劑的選擇就非常重要，佐劑的發(fā)展與新型疫苗的研發(fā)是相互密切聯(lián)系、相互促進(jìn)的，雖然現(xiàn)在有很多新型疫苗佐劑的研究，但是要真正用到疫苗生產(chǎn)當(dāng)中，還需要繼續(xù)努力研發(fā)，現(xiàn)在應(yīng)用最廣泛的佐劑依舊是鋁佐劑，但是對(duì)于小分子量抗原，鋁佐劑對(duì)其免疫應(yīng)答增強(qiáng)效果較弱，且它的副作用不可忽視，因此一個(gè)廣譜，高效，經(jīng)濟(jì)，無副作用的新型佐劑的研發(fā)迫在眉睫[13]。

目前國(guó)際上獲得認(rèn)證的佐劑有鋁佐劑、MF59、AS03、AS04、脂質(zhì)體[14]；鋁佐劑是目前應(yīng)用最廣泛的疫苗佐劑，被美國(guó)FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于人類，鋁佐劑價(jià)格便宜，吸附作用好，APC能夠攝取鋁佐劑上吸附的抗原，但其不良反應(yīng)值得關(guān)注，如皮疹、IgE介導(dǎo)的超敏反應(yīng)、甚至有報(bào)道稱可以引起神經(jīng)毒性[15]。MF59主要是用于流感疫苗中，是一種水包油佐劑，有發(fā)生炎癥性關(guān)節(jié)炎風(fēng)險(xiǎn)。AS03、AS04已被歐洲國(guó)家認(rèn)可且應(yīng)用于人類，但是AS04成本較高，AS03有誘發(fā)炎癥性關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險(xiǎn)。脂質(zhì)體用于HAV疫苗，雖能夠誘發(fā)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，但是由于穩(wěn)定性問題使脂質(zhì)體在生產(chǎn)上有一定的困難且相對(duì)成本比較高，這對(duì)疫苗的廣泛使用造成了一定的限制[16-17]。本實(shí)驗(yàn)主要是討論甘油-3-磷酸在免疫應(yīng)答中的作用，結(jié)果顯示其可以提高HAV誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的抗HAV抗體，在第4周的抗體效價(jià)明顯超過鋁佐劑組，并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在第8周時(shí)抗體效價(jià)最高，并且抗體效價(jià)與鋁佐劑相差不大，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此甘油-3-磷酸誘導(dǎo)HAV產(chǎn)生特異性的抗HAV抗體要比鋁佐劑的誘導(dǎo)更迅速，如果遇到突發(fā)傳染病，能夠迅速引起免疫應(yīng)答就顯得非常重要，同時(shí)還可作為天然的油脂來代替疫苗中添加的礦物油脂。甘油磷酸是一種生理性物質(zhì)，與外源性物質(zhì)相比其作為佐劑理論上具有更好的安全性。相比已經(jīng)認(rèn)證使用的這些佐劑，甘油-3-磷酸具有經(jīng)濟(jì)，高效，安全等新型疫苗佐劑應(yīng)有的特點(diǎn)，為發(fā)現(xiàn)新型疫苗佐劑提供新思路?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)來源于人類本身的一些物質(zhì)就有誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的作用，例如硫酸乙酰肝素，犬尿氨酸，尿苷二磷酸等，可以有效增強(qiáng)小鼠的體液免疫應(yīng)答，且安全性良好，具有開發(fā)為新型疫苗佐劑的潛力[18-20]。

綜上所述，甘油-3-磷酸能夠增強(qiáng)HAV誘導(dǎo)的小鼠體液免疫應(yīng)答，并且反應(yīng)性要比鋁佐劑快，而且甘油-3-磷酸是動(dòng)植物糖類和脂類代謝的中間物，避免了外源性物質(zhì)對(duì)小鼠的刺激，安全性良好，非常符合新型佐劑高效、經(jīng)濟(jì)、安全的條件，希望甘油-3-磷酸能夠開發(fā)為新型佐劑，應(yīng)用到疫苗的生產(chǎn)當(dāng)中，為人類的公共衛(wèi)生事業(yè)做出貢獻(xiàn)。