龔菁菁 李小紅 王存龍 李銀銀 陳振文 杜小燕

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069)

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一。在我國(guó)，隨著生活方式的改變及人口老齡化，DM的患病率不斷上升，成為繼心血管疾病和腫瘤之后的第三大嚴(yán)重危害人類健康的慢性終身疾病。我國(guó)成人糖尿病患病率平均為11.6%，患病人數(shù)已達(dá)到1.14億[1]。2型糖尿病是糖尿病的主要類型，約占糖尿病人的90%[2]。2型糖尿病是由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致的復(fù)雜遺傳病，以葡萄糖耐量降低、胰島素抵抗為主要特征[3]。但2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚，由于糖尿病是多基因控制的復(fù)雜疾病，易感基因的存在及其功能改變是影響糖尿病發(fā)生的重要因素。本課題組前期利用自行培育的近交系長(zhǎng)爪沙鼠2型糖尿病模型材料，通過抑制消減雜交(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)的方法在高血糖和正常血糖長(zhǎng)爪沙鼠骨骼肌中發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄因子κb(Nuclear factor κB，Nf-κb)差異表達(dá)。但其在自發(fā)性2型糖尿病長(zhǎng)爪沙鼠不同組織中的表達(dá)水平如何還不得而知。因此，本文主要研究Nf-κb在糖尿病沙鼠和正常沙鼠的骨骼肌、肝臟、腎臟、脂肪、心臟和腦組織中mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況，以期尋找長(zhǎng)爪沙鼠糖尿病模型致病機(jī)制中Nf-κb的作用和靶器官，為研究長(zhǎng)爪沙鼠2型糖尿病新模型的發(fā)生機(jī)制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取近交系糖尿病模型長(zhǎng)爪沙鼠和正常對(duì)照組沙鼠各6只，12～15周齡，雌雄各半。所有長(zhǎng)爪沙鼠均來(lái)自首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，飼養(yǎng)于控制溫濕度的普通環(huán)境中(SYXK(京)2013-0005)。

1.2 樣品采集

動(dòng)物過量麻醉安樂死后，解剖采集新鮮組織后立即置于液氮中。樣品包括患糖尿病和正常長(zhǎng)爪沙鼠的骨骼肌、肝臟、腹部脂肪、腎臟、心臟、腦組織。

1.3 RNA提取及cDNA的制備

從液氮中取出凍存的長(zhǎng)爪沙鼠6種組織，分別加入約1 mL TRIzol Reagent(Invitrogen，USA)，用均質(zhì)器將組織打碎，于室溫放置1 min，然后加入約200 μL的三氯甲烷，混勻后4 ℃放置15 min，4℃14 000 r/min 離心15 min，轉(zhuǎn)移上層水相至新離心管，加入約500 μL異丙醇，混勻后4 ℃靜置10 min，4℃ 14 000 r /min 離心15 min，棄上清。加入70%乙醇顛倒洗滌沉淀，4℃ 12 000 r/min 離心10 min，棄上清。重復(fù)以上步驟1次，以充分洗去沉淀所含鹽分。室溫自然干燥，加入適量的RNA-Free水溶解得到總RNA。脂肪組織的總RNA提取用脂肪RNA提取試劑盒進(jìn)行(Qiagen, USA)。采用Nanodrop 2000c(Thermo scientific, USA)分析RNA濃度和純度。按照快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)對(duì)上述總RNA樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到相應(yīng)的cDNA。

1.4 Q-PCR

按照SSH得到的Nf-κb基因片段序列，利用 Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物多對(duì)。除肌肉選取Gapdh基因作為內(nèi)參外，其他組織均選取β-actin基因作為內(nèi)參基因并設(shè)計(jì)引物。引物序列如表1所示，均由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

表1 Nf-κb和內(nèi)參基因Q-PCR引物序列

采用Real-time PCR法在Bio-Rad CFX96 manager System上對(duì)Nf-κb的mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)。所用試劑為實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(天根)，反應(yīng)體系為20μL。反應(yīng)條件如下: Q-PCR Master Mix 10μL，上游引物0.6μL，下游引物0.6μL，模板cDNA 1μL，ddH2O 7.8μL。反應(yīng)程序均為: 95℃ 15min，之后95℃ 10s，58℃ 35s，共擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)檢測(cè)熒光; 熔解曲線分析從60℃到95℃，每0.5 ℃檢測(cè)一次。

1.5 Western blotting

取液氮凍存的長(zhǎng)爪沙鼠骨骼肌、肝臟、腎臟、脂肪、心臟和腦組織，剪碎后用組織蛋白提取試劑盒(康為世紀(jì))提取總蛋白，用BCA定量法對(duì)蛋白進(jìn)行定量。取30μg總蛋白進(jìn)行SDS-AGE凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)蛋白至NC膜。以TBS(25 mmol/L Tris, 0.15 mol/L NaCl, pH7.2)含5%脫脂牛奶和0.05% Tween-20 封閉過夜。用Nf-κb抗體(1∶1 000稀釋，CST，USA)4 ℃孵育過夜，TBST洗滌后與二抗(辣根過氧化酶聯(lián)的抗兔血清)室溫孵育1 h，TBST洗膜后用化學(xué)發(fā)光法顯色。骨骼肌、肝臟、腎臟、心臟和腦組織選用Gapdh做內(nèi)參基因，脂肪組織選用β-actin作為內(nèi)參基因。最后用凝膠圖像分析系統(tǒng)(Bio-Rad)掃描蛋白質(zhì)印跡條帶灰度。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法分析。以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Nf-κb基因在糖尿病沙鼠和對(duì)照組的6種組織中mRNA表達(dá)的差異

采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR法分別檢測(cè)了糖尿病沙鼠和正常沙鼠的骨骼肌、肝臟、脂肪、腎臟、心臟和腦組織Nf-κb的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，在骨骼肌中Nf-κb在糖尿病組有高表達(dá)趨勢(shì)(圖1)。參考SSH的結(jié)果，該基因在糖尿病沙鼠中的表達(dá)量高于正常沙鼠，所以該結(jié)果與SSH結(jié)果相吻合。在脂肪、肝臟和心臟組織中，Nf-κb在糖尿病組的表達(dá)量均低于對(duì)照組，而脂肪組織mRNA表達(dá)量的降低有顯著性差異。在腎臟和腦組織中，Nf-κb在糖尿病組有高表達(dá)的趨勢(shì)。

圖1 Nf-κb在糖尿病和對(duì)照組長(zhǎng)爪沙鼠6種組織中的mRNA表達(dá)水平

2.2 NF-κB在糖尿病沙鼠6種組織中蛋白的表達(dá)水平

Western Blotting檢測(cè)NF-κB蛋白在6種組織中的表達(dá)結(jié)果顯示，骨骼肌中糖尿病組的蛋白水平高于對(duì)照組，與Real-timePCR的趨勢(shì)一致(圖2)。脂肪和心臟組織中NF-κB在糖尿病組中蛋白水平略低于對(duì)照組，與其mRNA的表達(dá)趨勢(shì)相一致。而肝臟、腎臟和腦組織中，糖尿病組與對(duì)照組相比NF-κB蛋白是略微增加的，腎臟和腦組織的NF-κB在mRNA和蛋白水平表達(dá)趨勢(shì)相吻合。

圖2 NF-κB在糖尿病沙鼠6種組織中蛋白的表達(dá)情況

3 討論

在糖尿病人群中，2型糖尿病人占比最高[4]，因此，對(duì)其機(jī)制的研究一直是糖尿病研究的熱點(diǎn)。2型糖尿病作為多基因控制的復(fù)雜疾病，尋找和確定易感基因尤為重要，目前對(duì)T2DM的病因和關(guān)鍵基因的篩選還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，通過糖尿病動(dòng)物模型篩選易感基因已成為研究2型糖尿病發(fā)病機(jī)制的重要的手段。近年來(lái)，越來(lái)越多自發(fā)性糖尿病動(dòng)物模型的出現(xiàn)能模擬各種人類糖尿病的癥狀，成為研究糖尿病遺傳相關(guān)分子機(jī)制的關(guān)鍵載體[5]。本課題組前期經(jīng)過定向培育逐步形成了一個(gè)長(zhǎng)爪沙鼠自發(fā)性糖尿病模型群體，其生化指標(biāo)和病理組織形態(tài)均符合糖尿病標(biāo)準(zhǔn)，且這些性狀具有遺傳性，是研究2型糖尿病的病生理特點(diǎn)以及致病機(jī)制理想的動(dòng)物模型和實(shí)驗(yàn)材料。為了更深入探索該模型發(fā)生的分子機(jī)制，我們又通過SSH方法從骨骼肌中篩選出糖尿病和正常沙鼠差異表達(dá)的基因并進(jìn)行序列比對(duì)和分類。本研究挑選出了其中可能與糖尿病和代謝相關(guān)的候選基因核轉(zhuǎn)錄因子κb(Nuclear factorκB，Nf-κb)進(jìn)行了不同組織器官的表達(dá)水平分析。

由于2型糖尿病是一類重要的代謝性疾病，外周組織和核心器官的代謝和功能都可能受到影響，本研究選取了骨骼肌、肝臟、脂肪、腎臟、心臟和腦組織進(jìn)行分析，因?yàn)檫@些組織器官均是重要的糖代謝器官或糖尿病受累器官。Nf-κb是一個(gè)重要的炎癥因子，而炎癥狀態(tài)與胰島素抵抗、肥胖、2型糖尿病等代謝綜合征的發(fā)展相關(guān)[6]。早在1986年，Sen和Baltimore[7]首次發(fā)現(xiàn)，在B細(xì)胞核提取物中有一種能與免疫球蛋白κ的輕鏈編碼基因增強(qiáng)子κB序列(GGGACTITCC)特異結(jié)合的核蛋白因子，稱之為Nf-κb。實(shí)際上，各種致癌物質(zhì)、生長(zhǎng)因子、微生物群和促氧化劑造成的炎癥刺激都可以激活Nf-κb，其在炎癥中起著核心作用，同時(shí)也在很多癌癥中表達(dá)[8]。Nf-κb通過調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，從而參與炎癥、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和腫瘤等相關(guān)的病理過程，且在2型糖尿病致病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。本試驗(yàn)對(duì)高血糖長(zhǎng)爪沙鼠和正常長(zhǎng)爪沙鼠幾種重要組織器官中Nf-κb的表達(dá)水平的研究結(jié)果表明，雖然在肝臟等器官中其表達(dá)水平有變化趨勢(shì)，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。只有在脂肪組織中的表達(dá)是降低的，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，肥胖能激活Nf-κb從而增加2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[8-9]，肥胖癥或肝臟脂肪變性的小鼠體內(nèi)低水平的IKK-β會(huì)增加Nf-κb的活性，從而促進(jìn)2型糖尿病的發(fā)展[10]。食源性肥胖小鼠的肝細(xì)胞中Nf-κb是高表達(dá)的，而抑制Nf-κb可以改善肝臟胰島素敏感性，并且抑制了cAMP/PKA通路。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在糖尿病長(zhǎng)爪沙鼠中，無(wú)論是肝臟還是脂肪中的Nf-κb都是低水平表達(dá)的，這可能是和我們挑選的動(dòng)物不是肥胖型糖尿病有關(guān)，也間接說明肥胖對(duì)Nf-κb的刺激在肥胖引起的糖尿病高風(fēng)險(xiǎn)中發(fā)揮更重要的作用。

總之，在長(zhǎng)爪沙鼠糖尿病模型中，我們發(fā)現(xiàn)Nf-κb在脂肪中的表達(dá)水平降低，可能與糖尿病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，這為研究長(zhǎng)爪沙鼠2型糖尿病的發(fā)生機(jī)制提供了一個(gè)新的思路。