香豆素和植物激素對北沙參種子萌發(fā)的影響

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(1.河北中醫(yī)學(xué)院，石家莊 050200； 2.安國數(shù)字本草檢驗中心有限公司，河北 安國 071200)

北沙參為傘形科植物珊瑚菜(GlehniaLittoralisFr.Schmidt ex Miq.)的干燥根，是我國傳統(tǒng)中藥材，具有養(yǎng)陰清肺，益胃生津的功效[1]，主產(chǎn)河北、山東、遼寧、內(nèi)蒙等省區(qū)[2]。北沙參主要以種子進(jìn)行繁殖，北沙參種子為深度休眠型[3]，發(fā)芽率很低[4]，嚴(yán)重制約著北沙參的規(guī)模化栽培種植發(fā)展。

北沙參種子發(fā)芽較低，一是因為種子成熟度不夠，胚尚未發(fā)育完全即成熟脫落；二是因為種子內(nèi)含有發(fā)芽抑制物——香豆素，香豆素是最早被認(rèn)為休眠誘導(dǎo)物的物質(zhì)之一[5]，其衍生物在自然界中廣泛分布，在萌發(fā)種子中能迅速代謝，對北沙參種子的萌發(fā)有一定的抑制作用；三是因為種子霉變等因素的影響。在北沙參種子的貯藏和層積過程中，種子胚乳發(fā)霉、糜爛等現(xiàn)象導(dǎo)致種子喪失了萌發(fā)力。

植物激素指植物細(xì)胞接受特定環(huán)境信號誘導(dǎo)產(chǎn)生的、低濃度時可調(diào)節(jié)植物生理反應(yīng)的活性物質(zhì)。它們在細(xì)胞分裂與伸長、組織與器官分化、開花與結(jié)實、成熟與衰老、休眠與萌發(fā)以及離體組織培養(yǎng)等方面，分別或相互協(xié)調(diào)地調(diào)控植物的生長、發(fā)育與分化。植物激素主要有生長素(Auxin)、赤霉素(GA)、細(xì)胞分裂素(CTK)、脫落酸(abscisic acid，ABA)、乙烯(ethyne，ETH)和油菜素甾醇(brassinosteroid，BR)。這些雖然是簡單的小分子有機(jī)化合物，但它們的生理效應(yīng)卻非常復(fù)雜、多樣，從細(xì)胞的分裂、伸長、分化，到種子的休眠、發(fā)芽、生根以及植物的開花、結(jié)果、脫落等方面有著重要的調(diào)節(jié)控制作用[6-9]。

本研究對干燥存儲1年、干燥存儲6個月以及低溫沙藏3個月的北沙參種子進(jìn)行4種植物激素(IAA、CTK、GA3、ABA)和5種香豆素成分(補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、異歐前胡素)的含量測定，以期分析不同保存時間的北沙參種子中植物激素和香豆素類成分的含量變化以及二者之間的關(guān)系，為深入研究北沙參種子的萌發(fā)機(jī)制提供參考。

1 實驗材料

北沙參種子由河北省安國市怡康藥業(yè)提供，經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院鄭玉光教授鑒定為傘形科珊瑚菜(GlehnialittoralisFr.Schmidt ex Miq.)的種子。樣品信息見表1。

表1 北沙參種子信息

樣本名稱樣品編號樣本狀態(tài)收樣日期樣品來源北沙參種子BSC1干燥儲存1年2017年3月12日河北安國北沙參種子BSC2干燥儲存6個月2017年3月12日河北安國北沙參種子BSC3沙藏3個月2017年3月12日河北安國

2 實驗儀器與試劑

2.1 實驗儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；CPA 225 D電子分析天平(賽多利斯(上海)貿(mào)易有限公司)；KQ-300 VDE型三頻數(shù)顯超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；GL-20 G-II型高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；Eporch酶標(biāo)儀(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司)；DGG-101-2 BS型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津天宇實驗儀器有限公司)。

2.2 實驗試劑

歐前胡素對照品(批號：ST 02340120 MG)購自上海詩丹德有限公司，花椒毒素對照品(批號：FY 132301109)、佛手柑內(nèi)酯對照品(批號：FY 12320913)購自南通飛宇生物技術(shù)有限公司，以上3種對照品純度均大于98%，補(bǔ)骨脂素對照品(批號：110739-201617，按99.7%計)、異歐前胡素對照品(批號：110827-201611，按99.4%計)購自中國食品藥品檢定研究院。色譜純乙腈(默克)，甲醇、乙醇為分析純，水為純凈水。

植物激素脫落酸(ABA)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(ELISA)(批號04/2017)、植物細(xì)胞分裂素(CTK)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(ELISA)(批號04/2017)、植物吲哚乙酸(IAA)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(ELISA)(批號04/2017)、植物赤霉素3(GA3)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(ELISA)(批號04/2017)均購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

3 實驗方法

3.1 北沙參發(fā)芽實驗

從北沙參種子中用鑷子挑選個大、飽滿的凈種子，在25 ℃室溫下經(jīng)清水浸泡24 h。向培養(yǎng)盒及鑷子上噴灑少量75%的酒精進(jìn)行消毒處理，紫外燈照射1 h進(jìn)行滅菌處理。在超凈工作臺中將已高溫高壓滅菌的濾紙平貼在已進(jìn)行消毒滅菌過的培養(yǎng)盒中，噴灑清水潤濕濾紙，用鑷子夾取北沙參種子30粒，整齊排列于培養(yǎng)盒的濾紙上，放入培養(yǎng)箱中，保持溫度25 ℃，濕度60%，光照66%，光周期為10 h黑暗，14 h光照。 每日觀察，補(bǔ)充水分，挑出霉?fàn)€種子，并記錄各發(fā)芽床中的發(fā)芽數(shù)。

3.2 北沙參種子香豆素類含量測定

采用HPLC法對北沙參種子中的補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、異歐前胡素進(jìn)行含量測定。

3.2.1 色譜條件

根據(jù)預(yù)實驗的實驗結(jié)果，篩選的色譜條件為：Dikma色譜柱：C 18(250 mm×4.6 mm，5μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～18 min，24%→30%A；18～29 min，30%→49%A；29～33 min，49%→72%A；33～40 min，72%A)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：295 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20μL。

3.2.2 混合對照品溶液制備

分別精密稱取歐前胡素7.60 mg、花椒毒素9.40 mg、佛手柑內(nèi)酯9.0 mg、補(bǔ)骨脂素8.90 mg、異歐前胡素10.10 mg置于5個100 mL的容量瓶中，加入甲醇溶解并定容，制得歐前胡素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、補(bǔ)骨脂素、異歐前胡素的質(zhì)量濃度分別為0.074 5，0.093 8，0.089 8，0.088 7，0.100 4 mg/mL的對照品貯備液。將以上單一對照品溶液進(jìn)行等體積混合，制成混合對照品溶液。

3.2.3 供試品溶液制備

種子用水浸泡24 h后取出(與激素含量測定的種子一起浸泡，浸泡時間相同)，低溫40.0 ℃烘干，打粉后過4號藥典篩，精密稱定約2 g，分別置于50 mL錐形瓶中，加入75%乙醇25 mL，稱重，超聲(功率500 W，頻率40 kHz)提取30 min，放冷，用75%乙醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，即得。每批制備3個平行樣。

3.2.4 線性方程及樣品含量測定

按“3.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，得到補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、異歐前胡素的線性方程。根據(jù)線性方程及樣品的峰面積計算出樣品中香豆素類成分含量。

3.3 植物激素類檢測方法

3.3.1 樣品前處理

種子用水浸泡24 h后取出用吸水紙將其表面吸干，稱取北沙參種子樣本，同時加入9倍體積的PBS進(jìn)行研磨(研缽需進(jìn)行預(yù)冷)，4 ℃冰箱內(nèi)浸提1 h，3 000 r/min離心30 min，取上清液備用。

表4 北沙參種子中香豆素含量 (n=3)

樣品組別補(bǔ)骨脂素花椒毒素(mg/kg)佛手柑內(nèi)酯(mg/kg)歐前胡素(g/kg)異歐前胡素(mg/kg)BSC1均值±SD未檢出45.81±1.42877.29±35.246.49±0.14152.89±1.06BSC2均值±SD未檢出41.53±0.56918.31±11.626.87±0.04152.77±3.04BSC3均值±SD未檢出24.16±0.59668.09±9.105.07±0.10117.09±2.74

3.3.2 ELISA實驗步驟

1) 標(biāo)準(zhǔn)品的加樣：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL。

2) 加樣：分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μL，然后再加待測樣品10μL(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣時將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3) 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑100μL，空白孔除外。

4) 溫育：用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min。

5) 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。

6) 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

7) 顯色：每孔先加入顯色劑A 50μL，再加入顯色劑B 50μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。

8) 終止：每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。

9) 測定：以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應(yīng)在加終止液后15 min以內(nèi)進(jìn)行。

10) 計算：以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

4 實驗結(jié)果

4.1 不同貯藏方法對北沙參種子發(fā)芽率的影響

將3種不同貯藏方式下的北沙參種子進(jìn)行發(fā)芽實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)低溫沙藏后的種子BSC 3發(fā)芽率最高，而干燥貯藏6個月以上的種子BSC 2發(fā)芽率很低，干燥貯藏時間越長種子發(fā)芽率越低，干燥貯藏1年的種子基本失去發(fā)芽能力。

4.2 北沙參種子中香豆素含量的檢測

4.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

取對照品貯備液適量，采用逐級依次稀釋，制得一系列質(zhì)量濃度的對照品溶液，按“3.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以質(zhì)量濃度(x，mg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性分析得到線性回歸方程(見表3)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2均為0.99左右，說明后續(xù)結(jié)果可信。

表2 3種不同貯藏方式下的北沙參種子的發(fā)芽率

樣品編號貯藏方式播種數(shù)發(fā)芽數(shù)發(fā)芽率(%)301BSC1干燥貯藏1年3003.33302303BSC2干燥貯藏6個月3027.783023020BSC3沙藏3個月301966.673021

表3 香豆素各成分檢測回歸方程

指標(biāo)回歸方程R2補(bǔ)骨脂素y=76201x+15.0320.9996花椒毒素y=64478x+21.6650.9998佛手柑內(nèi)酯y=62568x-115.510.9994歐前胡素y=51454x+40.5860.9993異歐前胡素y=48766x+106.110.9994

4.2.2 北沙參種子中香豆素類含量檢測結(jié)果

在3種北沙參種子的香豆素含量檢測中，補(bǔ)骨脂素未檢出，說明北沙參種子中的補(bǔ)骨脂素含量較低。在北沙參種子中含量較高的為佛手柑內(nèi)脂，最高可達(dá)918 mg/kg。對于干燥貯藏的北沙參種子BSC 1和BSC 2，二者所含的香豆素類成分大致相當(dāng)，而經(jīng)過低溫沙藏的北沙參種子BSC 3中的香豆素類各成分都明顯低于BSC 1和BSC 2(見表4)，說明在北沙參種子低溫沙藏的過程中，香豆素類的成分在逐漸減少，對種子萌發(fā)的抑制作用也在逐漸降低。

4.3 植物激素含量檢測結(jié)果

4.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

利用ELASA的方法檢測北沙參種子中的4種植物激素的含量，首先利用植物激素的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測，標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2均為0.99左右(表5)，說明后續(xù)結(jié)果可信。

表7 香豆素和植物激素含量相關(guān)性分析

花椒毒素佛手柑內(nèi)酯歐前胡素異歐前胡素ABACTKGA3IAA花椒毒素10.938**0.925**0.977**0.4770.470-0.029-0.831**佛手柑內(nèi)酯0.938**10.993**0.975**0.2980.192-0.056-0.893**歐前胡素0.925**0.993**10.972**0.3300.197-0.062-0.884**異歐前胡素0.977**0.975**0.972**10.4270.3360.021-0.839**ABA0.4770.2980.3300.42710.509-0.423-0.238CTK0.4700.1920.1970.3360.50910.092-0.196GA3-0.029-0.056-0.0620.021-0.4230.09210.076IAA-0.831**-0.893**-0.884**-0.839**-0.238-0.196-0.0761

注：“**”表示在 0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。

表5 植物激素檢測回歸方程

指標(biāo)回歸方程R2IAAy=0.0667x-0.00540.9979GA3y=0.0136x+0.03270.9963CTKy=0.0289x-0.01770.9976ABAy=0.0267x+0.03530.9992

4.3.2 4種植物激素含量檢測結(jié)果

4種植物激素檢測的結(jié)果表明，隨著貯藏時間的延長，北沙參種子中ABA、CTK和GA3含量略有升高，其含量的基本情況是BCS 1>BCS 2>BCS 3，說明隨著貯藏時間的延長以及干燥程度的加深，種子失去更多的水分，從而使ABA、CTK和GA3相對含量增加。但是IAA的含量并不因貯藏時間的延長而增加，干燥貯藏1年和6個月的北沙參種子中IAA的含量相當(dāng)，而經(jīng)過低溫沙藏的種子其IAA的含量則明顯高于干燥貯藏的種子(表6)，說明在低溫沙藏的過程中，隨著抑制種子萌發(fā)的香豆素類的明顯減少(表4)，與種子萌發(fā)相關(guān)的IAA開始大量合成，為種子的萌發(fā)做準(zhǔn)備。

表6 北沙參種子中植物激素含量(n=3)

激素種類BCS1BCS2BSC3ABA(ng/g)464.831 441.236 432.809 CTK(ng/g)307.388 252.024 255.830 GA3(pmol/g)594.743592.904592.537IAA(μmol/g)159.865151.544189.865

4.4 北沙參種子中香豆素和植物激素含量相關(guān)性分析

用SPSS 19.0軟件分析香豆素含量和植物激素含量之間的關(guān)系，結(jié)果見表7。香豆素的4種成分花椒毒素、 佛手柑內(nèi)脂、歐前胡素和異歐前胡素含量之間呈極顯著正相關(guān)(p<0.01)，而這4種成分和植物激素中的ABA、CTK和GA3的關(guān)系不明顯，只是和IAA呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(p<0.01)。說明香豆素的各個成分作為抑制種子萌發(fā)物質(zhì)其作用是相似的，而在種子萌發(fā)時，香豆素成分會逐漸減少，隨之而來的是促進(jìn)種子萌發(fā)的IAA的水平的升高。

5 討 論

種子的休眠是抑制種子萌發(fā)的主要因素，種子的休眠一般分為5種類型：生理休眠、形態(tài)休眠、形態(tài)生理休眠、物理休眠和聯(lián)合休眠。北沙參的種子屬于典型的形態(tài)生理休眠，它的種子在萌發(fā)前要進(jìn)行解除休眠的預(yù)處理而且預(yù)處理的時間較長[10]。這主要是因為北沙參中含有較多的香豆素類成份。香豆素類又稱為化感物質(zhì)[11]，目前多數(shù)的研究都集中在化感物質(zhì)對種子萌發(fā)的抑制作用[12-14]。本研究中，隨著干燥貯藏的時間延長，北沙參種子中香豆素類成分對種子萌發(fā)的抑制作用越明顯，而經(jīng)過低溫沙藏處理之后的香豆素類則明顯減少，相應(yīng)的種子的萌發(fā)力也明顯升高。

植物激素是調(diào)控種子休眠和萌發(fā)的重要內(nèi)源性因素[15]，以往的研究證明ABA和GA3在調(diào)控植物種子萌發(fā)的過程中起到了重要的作用，但最近的研究表明，IAA在植物種子的休眠和萌發(fā)中也起著重要的正向調(diào)控作用[16]。本研究中，干燥貯藏的北沙參種子的植物激素似乎沒有太大的變化，而經(jīng)過低溫沙藏的種子中，IAA的含量明顯增高，相應(yīng)的其萌發(fā)率也升高。

在植物種子萌發(fā)的過程中，化感物質(zhì)能夠影響植物種子萌發(fā)過程中植物激素的含量，打破植物內(nèi)源激素的平衡，從而導(dǎo)致種子無法萌發(fā)[11]。有研究表明，黃酮類化感物質(zhì)可以明顯的抑制獨行菜的種子中GA3氧化酶活性，進(jìn)而抑制種子的萌發(fā)[17-18]，而香豆素類化感物質(zhì)可以明顯的降低多花黑麥種子中吲哚乙酸氧化酶(IAAO)的活性，從而抑制種子萌發(fā)[19]。因此，在本研究中，經(jīng)過低溫沙藏處理的北沙參種子中香豆素含量明顯降低，對于IAAO的抑制作用也相應(yīng)降低，從而使IAA的合成加速，IAA含量明顯升高，為種子的萌發(fā)做好了準(zhǔn)備。