張崇軍，唐賢華*，趙 龍，朱克永，周 文，隋 明，舒學(xué)香

（1.四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 都江堰 611830；2.成都市華測(cè)檢測(cè)技術(shù)有限公司，四川 成都 610041）

黃曲霉毒素（aflatoxin，AFT）主要是指由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的一類有毒的次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于農(nóng)作物及食物中，黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為“Ⅰ”類致癌物，是一種毒性極強(qiáng)的劇毒物質(zhì)，對(duì)人及動(dòng)物肝臟組織具有破壞作用，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致肝癌甚至造成機(jī)體死亡[1-4]。目前，分離得到的AFT及其衍生物已有20多種，其中毒性和致癌性最大的是黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）[5-7]。主要危害包括對(duì)人體細(xì)胞的致癌作用、細(xì)胞毒性、對(duì)免疫系統(tǒng)的損害、肝臟細(xì)胞的毒性等。由于黃曲霉毒素對(duì)水稻、玉米、小麥等糧食作物有著很強(qiáng)的侵染性[8]，且大曲主要是以小麥、大麥、豌豆等糧食作物為原料，故大曲存在黃曲霉毒素污染的可能性[9]。近年來白酒安全問題不斷涌現(xiàn)，俗話說“曲為酒之骨”[10]，因此做好大曲生產(chǎn)過程中黃曲霉素的檢測(cè)對(duì)確保白酒質(zhì)量安全，保障消費(fèi)者健康很有必要。

目前關(guān)于黃曲霉毒素B1的提取方法主要包括超聲波處理、振蕩、微波處理、均質(zhì)和紫外線輻射等，林耀盛等[11]采用微波處理的方法提取米糠中的黃曲霉毒素B1，取得了較好的效果；王洪健等[12]采用紫外輻照處理來提取花生油中黃曲霉毒素B1；龔珊等[13]為了測(cè)定玉米中黃曲霉毒素B1，對(duì)超聲、振蕩、高速均質(zhì)3種樣品前處理提取方法的提取效果進(jìn)行了比較分析；畢春元等[14-15]選擇了超聲波處理的方法分別對(duì)花生和蠶豆中的黃曲霉毒素B1進(jìn)行了提取和工藝參數(shù)的優(yōu)化，為黃曲霉毒素B1的檢測(cè)提供了可靠的方法。為了加強(qiáng)大曲中黃曲霉毒素的溶解度和擴(kuò)散，有利于毒素的提取完全，綜合安全和經(jīng)濟(jì)性等方面的考慮，本研究采用超聲波處理從大曲中提取黃曲霉毒素B1，結(jié)合Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取條件以建立最適的提取方案來確立有效和準(zhǔn)確的檢測(cè)參數(shù)，為提高大曲安全性，進(jìn)一步保障濃香型白酒的生產(chǎn)安全奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

中高溫大曲：取自川南某制曲廠，貯存期為30d，取樣后密封保存。

1.1.2 試劑

甲醇、二氯甲烷、無水硫酸鈉（均為分析純）：成都科龍化工試劑廠；酶聯(lián)免疫試劑盒（96孔/48孔）：北京華安麥科生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

F50型酶標(biāo)儀：瑞士Tecan公司；SB-5200DTD型超聲波提取儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；DZKW-S-8型電熱恒溫水浴鍋：北京市光明醫(yī)療儀器有限公司；SORVALL Stratos型高速離心機(jī)：美國(guó)Thermo公司；φ15 cm快速定性濾紙：泰州市奧克濾紙廠。

1.3 方法

1.3.1 大曲中AFB1的提取[16]

準(zhǔn)確稱取粉碎混勻的大曲樣品10.00g，通過20目篩，置于250 mL具塞錐形瓶中，分別加入80 mL不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇-水溶液，在不同的溫度條件下，采用不同的超聲波功率提取不同的時(shí)間后，用快速定性濾紙過濾于錐形瓶中。吸取10 mL濾液于分液漏斗中，加入40 mL二氯甲烷，加塞振搖5 min，靜置分層（約30 min），棄下層相，再加入10 mL二氯甲烷于分液漏斗中，重復(fù)提取，合并二氯甲烷相，經(jīng)盛有約20 g預(yù)先用二氯甲烷潤(rùn)濕的無水Na2SO4濾紙漏斗過濾于錐形瓶中，以65℃水浴烘干，冷卻后加入10 mL體積比為1∶1的甲醇-水溶液，即為待測(cè)樣品。

1.3.2 AFB1的檢測(cè)

按照參考文獻(xiàn)[17]中酶聯(lián)免疫法檢測(cè)大曲中AFB1的含量。

1.3.3 AFB1提取工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

根據(jù)1.3.1，初始超聲功率為200 W、超聲時(shí)間為20 min、超聲溫度為30℃。采用單因素輪換法，依次考察甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)（45%、55%、65%、75%、85%）、超聲功率（140 W、160 W、180 W、200 W、220 W）、提取時(shí)間（15 min、20 min、25 min、30min、35min）、提取溫度（20℃、30℃、40℃、50 ℃、60℃）4個(gè)因素對(duì)大曲中AFB1提取率的影響。采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定AFB1濃度，平行試驗(yàn)3次，確定最佳提取工藝條件。

1.3.4 AFB1提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用4因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法[14-18]，以甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)（A）、超聲波功率（B）、提取時(shí)間（C）和提取溫度（D）為考察因素，以黃曲霉毒素B1的得率（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化大曲中AFB1的提取工藝。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

運(yùn)用Design-Exper（tVersion 8.0.6）軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，作出響應(yīng)曲面圖，并進(jìn)行線性回歸和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFB1提取工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)對(duì)AFB1提取效果的影響

甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)對(duì)大曲中AFB1的提取效果的影響見圖1。

圖1 甲醇溶液的體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃曲霉毒素B1提取效果的影響Fig.1 Effect of methanol solution volume fraction on the extraction effect of aflatoxin B1

由圖1可知，不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇溶液對(duì)AFB1提取效果影響較大，隨著甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)的提高，AFB1得率不斷增大，當(dāng)甲醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為55%時(shí)，AFB1的得率達(dá)到最大值，為2.27 μg/kg，之后又逐漸下降，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是隨著料液比的增加，固液接觸面積和濃度梯度增加，有利于大曲中的AFB1內(nèi)向外擴(kuò)散，使得AFB1得率增加。當(dāng)料液比繼續(xù)增加，醇溶性的雜質(zhì)溶解度增加，使AFB1的溶解被抑制，因此確定甲醇溶液的最佳體積分?jǐn)?shù)為55%。

2.1.2 超聲波功率對(duì)AFB1提取效果的影響

超聲波功率對(duì)大曲中AFB1的提取效果的影響結(jié)果見圖2。

圖2 超聲波功率對(duì)黃曲霉毒素B1提取效果的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on the extraction effect of aflatoxin B1

由圖2可知，當(dāng)超聲波功率范圍為140～200W時(shí)，AFB1得率隨著超聲波功率的增大不斷增加，說明黃曲霉毒素的提取率在不斷提高；當(dāng)超聲波功率為200 W時(shí)，AFB1的得率達(dá)到最大值，為2.33 μg/kg，繼續(xù)升高超聲波功率，AFB1得率逐漸降低，分析原因可能是隨著超聲波頻率增大，溫度升高，有利于大曲中其他醇溶性雜質(zhì)的溶出，影響黃曲霉毒素B1的測(cè)定。因此，綜合考慮確定最適超聲波功率為200 W。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)AFB1提取效果的影響

提取時(shí)間對(duì)大曲中AFB1的提取效果的影響結(jié)果見圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)黃曲霉毒素B1提取效果的影響Fig.3 Effect of the extraction time on the extraction effect of aflatoxin B1

由圖3可知，提取時(shí)間為15～25 min時(shí)，AFB1得率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)增長(zhǎng)速率較快；當(dāng)提取時(shí)間為25 min時(shí)，AFB1的得率達(dá)到最大值，為2.58 μg/kg，分析原因可能是由于黃曲霉毒素在甲醇/水溶液中的溶解度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，同時(shí)由于萃取過程中溫度升高，提取液黏度減少，擴(kuò)散系數(shù)增加，促使提取速度加快。提取時(shí)間過度延長(zhǎng)，使得提取溫度過高，雜質(zhì)的溶出量增加，使黃曲霉毒素的檢測(cè)受到干擾，另一方面成本費(fèi)用增大，造成溶劑損失，影響環(huán)保。綜合各方面因素考慮，確定黃曲霉毒素B1的最佳提取時(shí)間為25 min。

2.1.4 提取溫度對(duì)AFB1提取效果的影響

提取溫度對(duì)大曲中AFB1的提取效果的影響結(jié)果見圖4。

圖4 提取溫度對(duì)黃曲霉毒素B1提取效果的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction effect of the aflatoxin B1

由圖4可知，提取溫度為20～30℃時(shí)，AFB1得率隨提取溫度的升高逐漸提高；當(dāng)提取溫度為30℃時(shí)，AFB1得率達(dá)到最大值2.43 μg/kg，提取溫度再增加，AFB1得率呈緩慢下降的趨勢(shì)，這是因?yàn)闇囟壬吆笫笰FB1結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，同時(shí)雜質(zhì)的浸出量也增加，從而影響了提取效果。因此，確定黃曲霉毒素B1的最適提取溫度為30℃。

2.2 AFB1提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)（A）、超聲波功率（B）、提取時(shí)間（C）、提取溫度（D），以黃曲霉毒素B1得率（Y）為響應(yīng)值。利用Minitab軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)[18]，其因素與水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 AFB1提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for AFB1 extraction process optimization

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

2.2.2 回歸方程的建立及顯著性分析

利用Design-Expert8.06軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸模型方程：

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Variance analysis of the regression equation

由表3可知，回歸方程模型P值為0.000 1＜0.01，表明該方程擬合度較好。失擬項(xiàng)P值為0.219＞0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著，模型不失擬，選擇合理。該模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9406，說明該模型能解釋94.06%響應(yīng)值的變化，校正決定系數(shù)R2adj=0.871 3，說明該模型擬合程度較好[19]，試驗(yàn)誤差較小，因此可用此模型對(duì)大曲中AFB1的提取工藝條件進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

根據(jù)回歸方程一次項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小，可知影響大曲中AFB1提取效果的主次因素為B（超聲波功率）＞A（甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)）=D（提取溫度）＞C（提取時(shí)間）[20]。模型的一次項(xiàng)A、B、C、D對(duì)結(jié)果影響均不顯著（P＞0.05）；二次項(xiàng)A2、B2、D2、C2對(duì)結(jié)果影響均極顯著（P＜0.01）；交叉項(xiàng)AB、AC、BC對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其他項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響均不顯著（P＞0.05）。

2.2.3 AFB1提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面分析

各個(gè)因素間的交互作用對(duì)大曲中AFB1提取效果影響的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖見圖5。

等高線的形狀反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則與之相反[21]。由圖5可知，甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)、超聲波功率、提取時(shí)間和提取溫度間的交互作用對(duì)大曲中AFB1提取效果的影響均出現(xiàn)拋物面型關(guān)系，所得到的響應(yīng)面都存在一個(gè)極大值點(diǎn)，其中甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)、超聲波功率、提取時(shí)間分別與提取溫度的交互作用等高線呈橢圓形，對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。

圖5 甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)、超聲波功率、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)AFB1提取效果影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interactions between methanol solution volume fraction,ultrasonic power,extraction time and temperature on the extraction effect of AFB1

經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化，根據(jù)擬合二階模型公式得到理論上大曲中黃曲霉毒素B1的最佳提取工藝條件為甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)54.91%，超聲波功率199.44 W，提取時(shí)間24.86 min，提取溫度29.83℃，在此最優(yōu)條件下，AFB1得率的理論值為2.59 μg/kg?？紤]到實(shí)際操作的可行性，將上述最優(yōu)條件修訂為甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)55%，超聲波功率200 W，提取時(shí)間25 min，提取溫度為30℃。

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證該模型的有效性及實(shí)用性，在此最佳提取條件下對(duì)該模型做3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果測(cè)得AFB1得率為2.58 μg/kg，與預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致，因此，該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際AFB1的提取狀況。

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)、超聲波功率、提取時(shí)間和提取溫度4個(gè)因素，利用Design-Expert8.0.6軟件進(jìn)行4因素3水平的Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)，通過響應(yīng)面優(yōu)化得到大曲中AFB1的最佳提取工藝條件：甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)55%，超聲波功率200 W，提取時(shí)間25min，提取溫度為30℃。在此最優(yōu)條件下，大曲中AFB1的得率為2.58 μg/kg。