■隋美霞 海 風 王宗偉 王漢海

(1.濰坊學院山東省生物化學與分子生物學重點實驗室，山東濰坊261061；2.沈陽鳥島管理有限公司，遼寧沈陽110000；3.山東省壽光市畜牧獸醫(yī)管理局，山東壽光262700）

Zn元素因具有廣泛的生理生化功能而被稱為機體的“生命元素”，同時也是必需的微量元素之一。然而，不同狀態(tài)鋅源鋅在機體內的生物利用率有顯著差異。目前，生物制品中的Zn大多停留在應用原子吸收光譜進行鋅的含量研究[1]，并未涉及到其結構，X射線吸收精細結構（X-ray absorption fine structure，XAFS）技術不只是局限于結晶物質結構和物質電子結構的研究，還可研究吸收原子的幾何結構和化合態(tài)。此外，XAFS技術能檢測出與該微量元素相臨界元素的氧化狀態(tài)。目前，對Zn元素的研究主要集于飼養(yǎng)試驗，大多數(shù)是對日糧中添加不同狀態(tài)鋅源的效果進行了報道，但對其在反芻動物十二指腸內的吸收特點及消化機理研究甚少，主要原因是缺乏有效的測定方法。本試驗目的是應用XAFS探討外翻腸囊試驗條件下，不同狀態(tài)的鋅源鋅經綿羊十二指腸腸囊吸收后濃度及狀態(tài)變化。探索XAFS技術在動物營養(yǎng)研究中Zn的應用，并為反芻動物不同狀態(tài)鋅源的合理應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

不同狀態(tài)鋅源鋅標準品:氧化鋅，ZnO含量≥95.00%，Zn含量76.75%；硫酸鋅，ZnSO4含量≥97.00%，Zn含量35.55%；蛋氨酸鋅，ZnMet含量≥81.50%，Zn含量18.97%；賴氨酸鋅，ZnLys含量≥28.00%，Zn含量5.31%。

在上海光源XAFS試驗站進行Zn元素的XAFS譜測定，其中，電子能量為800 MeV，平均電流強度為105.6 mA。

1.2 試驗設計

選取體格健壯、體重相近的18頭綿羊作為十二指腸的供體動物，禁食12 h，屠宰，立即分離出10 cm長的十二指腸中段，用39～40℃的生理鹽水沖洗，參照Seal等[2]所述方法，制成外翻腸囊，立即投入盛有20 ml按試驗處理安排配制的不同形態(tài)鋅培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，向瓶內充入95%O2和5%CO2后，密閉條件下40℃水浴振蕩培養(yǎng)(100 r/min)40 min[3]，整個過程不應超過15 min（保證腸段具有正常的生理機能）。按等量鋅在上述處理中加入6種不同鋅源（ZnO、ZnSO4、ZnMet、ZnLys、ZnSO4+Met、ZnSO4+Lys）。培養(yǎng)結束后，腸段用生理鹽水反復沖洗，65℃干燥24 h，待用。同步輻射裝置上測定Zn的XAFS譜，同時測定鋅源標準品（ZnO、ZnSO4、ZnMet、ZnLys）的XAFS譜。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗所得數(shù)據(jù)應用 origin（6.1）軟件整理后，同時進行歸一化分析。

2 結果與分析

2.1 不同鋅源標準品的XAFS譜

飼料級標準品鋅源的K邊XAFS譜見圖1。

在XAFS圖譜中，Zn的K邊吸收值為9 659 eV，總能量范圍在100 eV內。通過圖譜可以看出，四種鋅源標準品的XAFS譜吸收值差距明顯，兩種無機鋅較兩種有機鋅的K邊吸收值顯著增大。ZnO與另外三種鋅源不同點主要表現(xiàn)為，其在主吸收峰的低結合能一側有肩峰，表明樣品中飼料級ZnO中的Zn可能存在兩種或兩種以上的不同化學狀態(tài)，但其主化學狀態(tài)為ZnO；此外，局域結構也有所不同，這可能是鋅周圍氧原子數(shù)目不同導致形成的。其它三種鋅源譜線表明基本只有一種化學狀態(tài)。由以上譜線顯示的能量和局域結構可以看出，Zn在這四種標準品中的結構存在顯著差異。

圖1 四種標準品鋅的K邊XAFS譜線

2.2 十二指腸腸囊中不同鋅源的濃度和結構變化

十二指腸腸囊中四種鋅源（ZnO、ZnSO4、ZnMet、ZnLys）的K邊XAFS譜線見圖2。

圖2 十二指腸腸囊中不同鋅源的K邊XAFS譜線

由圖2可以看出，經過密閉震蕩培養(yǎng)40 min后，ZnO、ZnSO4、ZnMet、ZnLys四種鋅源的譜線基本相同，但有機鋅組（ZnMet、ZnLys）相對濃度明顯優(yōu)于無機鋅組（ZnO、ZnSO4），ZnMet突變最大，ZnO突變最小，即十二指腸壁中ZnMet組鋅濃度最高，ZnO組鋅濃度最低，這說明在十二指腸體外培養(yǎng)過程中有機鋅較易吸收。此外，從該圖中也可以看出有機鋅較無機鋅K邊吸收值較小，但四種鋅源吸收峰后的曲線形狀非常相似，說明經過體外培養(yǎng)十二指腸壁中Zn的化學狀態(tài)相同。

十二指腸腸囊中不同鋅源（ZnSO4、ZnMet、ZnLys、ZnSO4+Met、ZnSO4+Lys）的K邊XAFS譜線見圖3。

圖3 十二指腸腸囊中不同鋅源的K邊XAFS譜線

由圖3可以看出，經過密閉震蕩培養(yǎng)40 min后，這5種鋅源的譜線基本相同，吸收峰后的曲線形狀非常相似，說明經過體外培養(yǎng)十二指腸腸囊中Zn的化學狀態(tài)相同，但是其相對濃度卻發(fā)生了明顯變化，順序 依 次 為 ZnSO4+Met＜ZnSO4+Lys＜ZnSO4＜ZnLys＜ZnMet。

ZnSO4、ZnSO4+Met、ZnSO4+Lys三種鋅源來說，ZnSO4的突變最大，其相對濃度相對最高，而ZnSO4+Met、ZnSO4+Lys這兩組差別不大，說明雖然在ZnSO4中添加了蛋氨酸和賴氨酸，但在吸收過程中，這兩種游離氨基酸并未促進鋅元素的吸收，反而抑制其吸收。

對于 ZnSO4、ZnMet、ZnSO4+Met三種鋅源來說，ZnMet的突變最大，其相對濃度相對最高，其次是Zn-SO4，最后是ZnSO4+Met，說明有機鋅較易被吸收，添加蛋氨酸抑制鋅元素的吸收，但是其結構均相同。Zn-SO4、ZnLys、ZnSO4+Lys三種鋅源的吸收情況與ZnSO4、ZnMet、ZnSO4+Met的相似。

3 討論

3.1 XAFS技術測定元素的優(yōu)越性

同步輻射XAFS技術除了能夠定性定量檢測大多數(shù)的微量元素，且能研究吸收原子的幾何結構和化合態(tài)，鑒于此，XAFS技術將是生命科學研究的重要手段[4]。但目前XAFS技術在生物樣品中的應用較少，僅有少量研究報道了應用Synchrotron radiation評定飼料中的微量元素[5]，但試驗結果顯示，XAFS譜峰值對不同元素的價態(tài)均極為敏感，不同價態(tài)微量元素的XAFS譜可以很好被分開。

3.2 外翻腸囊技術在動物試驗中的優(yōu)越性

外翻腸囊技術即從屠宰的動物活體立即取出小腸后分割，將各片段外翻結扎，向囊狀物中注入特定的培養(yǎng)液（不含待測物質），立即將其放入特定的含有待檢測物質的培養(yǎng)液中，通過檢測腸囊中待檢測物質的含量及狀態(tài)變化，從而明確元素吸收情況[6]。Evans[7]采用該方法研究了大鼠整段小腸Zn元素的最佳吸收部位，認為外翻腸囊法是目前有效的研究微量元素吸收的方法。

3.3 十二指腸腸囊Zn的相對濃度和狀態(tài)變化

該試驗結果可看出，在外翻腸囊試驗條件下，十二指腸中有機鋅較無機鋅更容易被吸收。Ashmead等[8]的研究結果顯示，大鼠分離不同腸段對有機銅的吸收率是無機銅的4倍，這與本試驗所得結果一致。但是Hill等[9]利用大鼠十二指腸外翻腸囊技術結果顯示，三種鋅源（氯化鋅、蛋氨酸鋅、賴氨酸鋅）中Zn元素在培養(yǎng)后液體中的出現(xiàn)率并無顯著差異，表明有機鋅和無機鋅的生物學活性相似。這與本試驗結果有較大差異，出現(xiàn)上述結果不一致的原因可能與試驗方法、所用試驗動物的種類、所處的生理狀態(tài)不同有關。

本試驗在無機鋅中添加游離氨基酸，非但沒有促進鋅元素的吸收，反而抑制其吸收。計峰[10]通過外翻腸囊方法研究結果表明，無機錳與兩種氨基酸（甘氨酸、蛋氨酸）混合物的吸收率都比單一無機錳的吸收率要小，這與本試驗結果一致。Wapnir等[11]研究結果表明，較小分子量配體從某種程度上可以絡合Zn，從而達到防止Zn元素在生理pH值條件下生成沉淀的效果，因而可促進Zn元素的吸收，且當配體與鋅的比例小于或等于3∶1時作用最有效，此結論被過量組氨酸可競爭性抑制組氨酸鋅的吸收所證實。Bonewitz[12]認為，小分子量配體的作用是使飼糧中的鋅更易吸收，而不是鋅轉運體系中不可缺少的組成成分。本試驗中添加蛋氨酸及賴氨酸，可能是由于添加過量，過量的蛋氨酸及賴氨酸競爭性地抑制了鋅元素的吸收，所以鋅的吸收相對減少。

國內外學者研究結果顯示，大鼠腸道對Zn元素的吸收包含兩個基本過程，即飽和載體調節(jié)及非飽和擴散[13-16]。Hempe等[17]認為，這種現(xiàn)象表明Zn元素在機體腸道內的吸收可分為跨細胞吸收和細胞間擴散兩大類。本試驗通過外翻腸囊技術研究綿羊十二指腸對不同狀態(tài)Zn的吸收，其中四種標準品中Zn的狀態(tài)不相同，所處環(huán)境亦不同，但經過綿羊十二指腸吸收后，四種結構狀態(tài)反而相差不大，極為相似，這說明有機鋅的吸收途徑可能與無機鋅的相似，即從吸收機理而言，有機鋅與無機鋅一樣，即通過不依賴于載體調節(jié)的非飽和擴散形式被機體吸收的，有機鋅首先解離成離子，然后通過無機鋅的吸收途徑被機體腸道所吸收。于昱[18]通過試驗結果提出了有機鋅與無機鋅的吸收途徑相似的假設，本試驗結果確定了于昱提出的有機鋅的吸收假說，本試驗采用XAFS技術檢測十二指腸腸囊鋅元素的吸收狀態(tài)，較于昱方法更為成熟，樣品處理更簡便，而且試驗誤差很小。

4 結論

本試驗應用先進的XAFS技術，樣品制備過程簡易，測定結果更為準確，但影響因素相對較少。此外，通過外翻腸囊技術研究機體腸段對不同狀態(tài)Zn的吸收，試驗結果顯示有機鋅優(yōu)于無機鋅，有機鋅更易被吸收，確定十二指腸腸道中有機鋅的吸收機理與無機鋅的相同。此外，本試驗結果顯示，無機鋅與配體蛋氨酸及賴氨酸的結合反而抑制了鋅元素的吸收，這可能與無機鋅與配體比例有關，有必要開展進一步研究。但本試驗是在外翻腸囊的試驗條件下測定的，有必要進一步開展體內試驗加以驗證，在既不影響動物營養(yǎng)需要，又能提高鋅的吸收及利用率的前提下，應用適宜廉價的鋅添加劑，從而降低飼養(yǎng)成本。