■ 欒林林 張永剛 王鳳軍 任 媛 任 海 李 強(qiáng) 靳曉敏*

（1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023；2.淮海工學(xué)院海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇連云港222002；3.河北科技師范學(xué)院河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北昌黎066600）

大菱鲆（Scophthalmus maximus）音譯名“多寶魚”，俗稱歐洲比目魚[1]，因其具有較高的經(jīng)濟(jì)效益，目前已成為我國(guó)海水養(yǎng)殖魚類產(chǎn)量最大的品種[2]。隨著大菱鲆養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量逐年擴(kuò)大，及高密度工廠化養(yǎng)殖技術(shù)的推廣，在養(yǎng)殖過程中其細(xì)菌性疾病頻發(fā)。國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道，目前細(xì)菌性疾病的主要病原以弧菌為主，包括鰻弧菌（V.anguillarum）、哈維弧菌（V.harveyi）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、溶藻弧菌（V.alginolyticus）、殺鮭弧菌（V.salmonicida）、燦爛弧菌（V.splendidus）等[3-4]。

2017年5月，河北昌黎某養(yǎng)殖場(chǎng)大菱鲆發(fā)生病害并伴有死亡，主要癥狀為鰓蓋、體表有出血點(diǎn)，腹腔膨脹有積液，肝臟、脾臟充血或出血，腸道內(nèi)有淡黃色黏液。筆者從患病大菱鲆肝臟中分離獲得一株優(yōu)勢(shì)菌DLP-1，對(duì)其進(jìn)行人工感染試驗(yàn)。攻毒試驗(yàn)顯示大菱鲆死亡率高達(dá)85%，并從肝臟中分離到該菌，證明其為此次發(fā)病的病原菌。并通過對(duì)該菌的主要理化性狀及16S rRNA基因序列鑒定，結(jié)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹表明，該病原菌為鰻弧菌（Vibrio anguillarum）。同時(shí)對(duì)該菌的藥物敏感性進(jìn)行檢測(cè)。旨在明確其病原菌及敏感藥物，為大菱鲆健康養(yǎng)殖及疾病防治提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 病魚來源

患病及瀕死大菱鲆均取自河北昌黎某大菱鲆養(yǎng)殖場(chǎng)，體長(zhǎng)約25 cm，體重400～500 g。試驗(yàn)用健康大菱鲆取自河北昌黎另一大菱鲆養(yǎng)殖場(chǎng)，規(guī)格相似，于水溫18～19℃條件下暫養(yǎng)7 d。

1.2 試驗(yàn)試劑

ATB自動(dòng)鑒定系統(tǒng)及ID32E細(xì)菌鑒定試劑條購(gòu)于法國(guó)梅里埃生物公司；TianGen細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒及引物均購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司；普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂購(gòu)于北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；藥敏紙片購(gòu)于杭州天和微生物試劑有限公司；五倍子等24種中草藥均購(gòu)于河北昌黎百草堂大藥房。

1.3 病原體的分離鑒定

在無菌情況下，用接種環(huán)取患病大菱鲆肝臟等組織接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂，28℃倒置培養(yǎng)24～48 h，根據(jù)菌落大小、顏色、邊緣光滑程度等形態(tài)學(xué)特征對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離純化。將純化后的菌株置于20%甘油的保種液中，-80℃冰箱保存。

挑取純化培養(yǎng)的單菌落，用滅菌生理鹽水稀釋后進(jìn)行涂片革蘭氏染色，用顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)，拍照。吸取40 μl菌懸液加入ID32E生化鑒定試紙條的各孔中，在需厭氧培養(yǎng)的孔中加入礦物油，置于濕盒，28℃培養(yǎng)12～24 h；次日在吲哚試驗(yàn)孔加入1滴James，將試紙條置于ATB自動(dòng)鑒定系統(tǒng)中進(jìn)行鑒定。

在無菌條件下接種純培養(yǎng)菌于5 ml營(yíng)養(yǎng)肉湯中，28℃110 r/min振蕩培養(yǎng)16 h。采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行細(xì)菌DNA的提取。利用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和 1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACG ACTT-3′)對(duì)細(xì)菌總DNA的相應(yīng)序列進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)得16S rRNA基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫核酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)合其理化特性對(duì)菌種進(jìn)行歸類判定。

1.4 動(dòng)物回歸感染試驗(yàn)

選取體色正常、活力旺盛的大菱鲆個(gè)體分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組10尾，均設(shè)置3個(gè)平行。將分離菌接種到肉湯培養(yǎng)基中搖菌，28℃培養(yǎng)過夜，取1 ml菌液于1.5 ml離心管，3 000 r/min離心2 min，棄去上清液，制成菌懸液。參考沈萍等[5]的方法，將菌懸液濃度調(diào)為5.0×108CFU/ml。采用腹腔注射法進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，每尾注射0.2 ml。對(duì)照組大菱鲆注射等量無菌生理鹽水。試驗(yàn)周期為7 d，間隔6 h觀察大菱鲆有無異常情況，并記錄試驗(yàn)魚發(fā)病及死亡情況。

如人工感染的試驗(yàn)魚癥狀與自然發(fā)病魚相同或相似，則再次細(xì)菌分離鑒定，以明確病原菌。如經(jīng)人工感染后發(fā)病癥狀與原癥狀不同則排除初次分離菌。

1.5 病原菌的藥敏試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法（K-B法）。用滅菌棉簽蘸取稀釋后的菌懸液，均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板表面，將氟苯尼考等22種藥敏紙片貼于平板表面，每個(gè)培養(yǎng)皿貼6片，28℃培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈情況，用直尺測(cè)量抑菌圈直徑。藥敏結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)參考NCCLS手冊(cè)2017版。

參考張永剛等[6]的方法制備中草藥液，并在其基礎(chǔ)上略加改進(jìn)。將得到的中草藥液經(jīng)高壓滅菌121℃15 min后，置于4℃冰箱冷藏備用。采用牛津杯打孔法，對(duì)五倍子等24種中草藥進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。用滅菌棉簽蘸取菌懸液，均勻涂布于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂打孔培養(yǎng)基上，每孔各加入180 μl各中草藥原液，28℃培養(yǎng)24 h后查看結(jié)果，每種中草藥3個(gè)平行。判定標(biāo)準(zhǔn)參考葉應(yīng)嫵[7]編寫的《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》，抑菌圈直徑≥20 mm判定為高度敏感(S)、10～19 mm為敏感(I)、小于10 mm的為耐藥(R)、無抑菌圈形成(記作 0)。

采用96孔酶標(biāo)板，微量二倍稀釋法測(cè)定MIC和MBC[8]。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)特性

在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板接種純化病原菌，28℃培養(yǎng)24 h，DLP-1為圓形光滑、邊緣整齊、較隆起不透明、淡黃色菌落，直徑約0.8～1.0 mm（圖1）。革蘭染色為陰性、兩端鈍圓的短桿狀，有的菌體彎曲呈弧形（圖2）。

圖1 菌株DLP-1培養(yǎng)形態(tài)

圖2 菌株DLP-1革蘭氏染色（H.E.，100×）

2.2 菌株DLP-1生理生化特性

從表1可知，d-葡萄糖、過氧化氫酶、吲哚及賴氨酸脫羧酶陽性；精氨酸雙水解酶、硫化氫陰性；參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)》中弧菌屬的特征，對(duì)菌株DLP-1進(jìn)行分類地位的鑒定，初步鑒定篩選菌株屬于弧菌科。

表1 菌株DLP-1的生理生化特性

2.3 16S rRNA基因序列測(cè)定結(jié)果及菌種判定

采用通用引物對(duì)菌株DLP-1的16S rRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，使用Blast軟件對(duì)所獲得測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列相似性比對(duì)分析，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。結(jié)果表明，本研究分離獲得的菌株DLP-1屬于弧菌科弧菌屬(Vibrio)，與鰻弧菌(Vibrio anguillarumDSM 21597 CP010084)的相似性為99%。

2.4 人工感染試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組魚在感染后第2 d活力減弱，體表背側(cè)出現(xiàn)紅色瘡口、尾鰭末端潰爛，腹部膨脹、局部有潰爛灶、鰓糜爛。解剖可見腹腔充滿積液，腸內(nèi)充滿淡黃色黏液，膽囊發(fā)黑、肝臟蒼白，與自然發(fā)病魚癥狀相同。取瀕死魚血液、肝、脾接于普通營(yíng)養(yǎng)平板上分離純化，經(jīng)鑒定與分離菌株特性相同，通過16S rRNA基因序列分析鑒定為鰻弧菌，對(duì)照組魚正常。

2.5 藥物的敏感性測(cè)定

圖3 基于16S rRNA基因序列的菌株DLP-1系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5.1 西藥敏感性結(jié)果(見表2)

由表2可知，氟苯尼考、慶大霉素和他唑巴坦等11種藥物對(duì)鰻弧菌的抑菌作用最明顯，抑菌圈直徑最大，為理想的抑菌藥物；對(duì)四環(huán)素、氨芐西林及克林霉素等11種藥物耐藥。

2.5.2 中草藥敏感性結(jié)果（見表3、表4）

表2 22種藥物對(duì)鰻弧菌的抑菌效果

表3 24種中草藥對(duì)鰻弧菌的抑菌效果

由表3可見：五倍子、菌陳、黃岑、烏梅及赤芍五種中草藥對(duì)鰻弧菌的抑菌作用最明顯，抑菌圈直徑最大，為理想的抑菌藥物；對(duì)梔子、連翹等10種中草藥敏感；對(duì)車前子、白頭翁及益母草等9種中草藥耐藥。

表4 優(yōu)選中草藥對(duì)鰻弧菌的MIC和MBC的影響

由表4可見，在優(yōu)選中草藥中，五倍子抑菌、殺菌效果最強(qiáng)，MIC為1.512 5 mg/ml、MBC 12.5 mg/ml，烏梅、黃岑、連翹及梔子抑菌、殺菌效果較強(qiáng)，而赤芍及菌陳抑菌效果最弱，MIC均為50 mg/ml，且未檢測(cè)出其MBC。

3 討論

本試驗(yàn)挑選常用中草藥24種、西藥22種，以患病大菱鲆分離得到的鰻弧菌DLP-1為供試菌，進(jìn)行抑菌藥物的篩選。結(jié)果表明，DLP-1對(duì)氟苯尼考、頭孢唑啉、慶大霉素等藥物高敏，抑菌圈直徑均在20 mm以上。張昕等[9]用8種常用抗生素藥物對(duì)四種海洋致病弧菌進(jìn)行藥物敏感性測(cè)試，結(jié)果表明鰻弧菌對(duì)氯霉素、慶大霉素具有敏感性，但對(duì)卡那霉素、青霉素等其他所測(cè)藥物均表現(xiàn)出耐藥性。本試驗(yàn)抑菌效果與其相似，但鰻弧菌對(duì)抗生素的敏感性有差異，可能不同地區(qū)大菱鲆患鰻弧菌后使用的藥物不同從而導(dǎo)致敏感性不同，也可能由于不同地區(qū)菌株有所差異導(dǎo)致結(jié)果不同。

在中草藥抑菌試驗(yàn)中，DLP-1對(duì)五倍子、赤芍、菌陳、烏梅、黃岑高敏，其中五倍子抑菌、殺菌效果最佳，MIC為1.512 5 mg/ml，MBC為12.5 mg/ml。梁利國(guó)等[10]用4種常用中草藥對(duì)病原弧菌（鰻弧菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌、河口弧菌）體外抗菌效果作出了研究，其中蘇木、五倍子、地錦草、石榴皮4種中草藥具有較好的抑菌和殺菌作用，MIC和MBC分別為1.56～3.12 mg/ml和3.12～6.25 mg/ml；張明等[11]用20種中藥對(duì)鰻弧菌抑菌殺菌作用研究發(fā)現(xiàn)，黃芩、五倍子、石榴皮等5種中藥對(duì)鰻弧菌的抑菌作用效果顯著，MIC和MBC分別為3.125 mg/ml和6.25 mg/ml。本試驗(yàn)抑菌效果與其相似，但抑菌濃度卻是其10倍以上。可能是不同菌株間對(duì)藥物的敏感性有差異，這點(diǎn)從梁利國(guó)等對(duì)四種弧菌的測(cè)定結(jié)果可以證實(shí)；也可能由于試驗(yàn)方法及藥物的熬制方法不同，導(dǎo)致結(jié)果有所差異。但本試驗(yàn)只進(jìn)行了中草藥的體外抗菌試驗(yàn)，其結(jié)果可作為中草藥防治鰻弧菌感染的依據(jù)，在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用效果有待進(jìn)一步驗(yàn)證。