(上饒師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，江西 上饒 334001)

我國(guó)是全球最大的蘋果生產(chǎn)國(guó)[1]，蘋果中含有豐富的糖類、維生素、礦物質(zhì)及多酚類物質(zhì)[2]。蘋果中的多酚類物質(zhì)主要是原花色素。原花色素又稱縮合單寧或縮合鞣質(zhì)，由黃烷-3-醇單體縮合而成，也是近年來(lái)不斷研究和開(kāi)發(fā)的一種生物活性物質(zhì)[3-4]。經(jīng)過(guò)藥理研究證實(shí)原花色素具有抗氧化 、抗癆 、抗突變 、抗真菌 、抗腹瀉、抗過(guò)敏及降低毛細(xì)血管通透性等多種功能[5-6],在醫(yī)藥、保健品和化妝品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[7]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)蘋果原花色素的研究主要集中在原花色素的提取條件[8-10]，而關(guān)于蘋果原花色素分離及其抗氧化作用的文獻(xiàn)較少[11]，特別是采用大孔吸附樹(shù)脂分離蘋果原花色素的研究更少[12]。本研究?jī)?yōu)化了蘋果原花色素的提取工藝，并采用大孔吸附樹(shù)脂對(duì)蘋果原花色素粗提液進(jìn)行分離，比較分離前后蘋果原花色素對(duì)超氧陰離子自由基的清除率，分析分離操作對(duì)蘋果原花色素抗氧化作用的影響，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用蘋果原花色素提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

市售紅富士蘋果；兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%,質(zhì)量分?jǐn)?shù))；D101、AB-8、HPD100大孔吸附樹(shù)脂；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；NL104型電子天平；UV-2102型紫外可見(jiàn)光光度計(jì)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蘋果原花色素含量測(cè)定及提取率計(jì)算

以兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，采用香草醛-鹽酸法[13]繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立線性回歸方程。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得的線性回歸方程為：y=2.482 9x+0.020 8(r=0.998 3)，線性范圍為0～0.40 mg/mL。

提取液中蘋果原花色素含量的測(cè)定及提取率計(jì)算。準(zhǔn)確吸取蘋果原花色素提取液1mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法操作，測(cè)定其吸光度，由線性回歸方程計(jì)算提取液中蘋果原花色素含量，并按式(1)計(jì)算蘋果原花色素的提取率(%)。

(1)

式中C為提取液中蘋果原花色素的含量(mg/mL)，V為提取液體積(mL)，W為蘋果質(zhì)量(g)。

1.2.2 蘋果原花色素提取工藝流程

準(zhǔn)確稱量去皮蘋果10 g，研磨充分，加入一定體積的乙醇溶液，在一定溫度下回流一定時(shí)間，四層紗布過(guò)濾，棄渣，濾液用相應(yīng)濃度的乙醇溶液定容至100 mL，按1.2.1測(cè)定其中蘋果原花色素含量，計(jì)算蘋果原花色素提取率。

1.2.3 蘋果原花色素提取條件單因素和正交試驗(yàn)

以蘋果原花色素提取率為參考指標(biāo)，分別考察乙醇濃度(體積分?jǐn)?shù)，下同)、料液比、提取時(shí)間、提取溫度等因素對(duì)蘋果原花色素提取率的影響；再在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)，優(yōu)化蘋果原花色素的提取工藝。每組試驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.4 三種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)蘋果原花色素靜態(tài)吸附與解吸效果比較

D101、AB-8、HPD100等三種大孔吸附樹(shù)脂按文獻(xiàn)[14]進(jìn)行預(yù)處理。準(zhǔn)確稱取三種大孔吸附樹(shù)脂各5.0 g于錐形瓶中，分別加入按最佳提取工藝條件提取的蘋果原花色素提取液50 mL，室溫下100 r/min振蕩24 h，過(guò)濾，按1.2.1測(cè)定濾液中原花色素含量，按式(2)分別計(jì)算三種樹(shù)脂的吸附率(%)。

將上述三種吸附后的大孔吸附樹(shù)脂各四份分別置于錐形瓶中，每種大孔吸附樹(shù)脂分別加入25%、50%、75%、100%的乙醇溶液50 mL，室溫下100 r/min振蕩24 h，過(guò)濾，按1.2.1測(cè)定濾液中原花色素含量，按式(3)分別計(jì)算三種樹(shù)脂采用不同濃度乙醇溶液解吸的解吸率(%)。每組試驗(yàn)重復(fù)兩次。

吸附率=(C1V1-C2V2)×100/C1V1

(2)

解吸率=C3V3×100/(C1V1-C2V2)

(3)

式中C1為吸附前提取液中原花色素含量(mg/mL)，C2為吸附后濾液中原花色素含量(mg/mL)，C3為解吸液中原花色素含量(mg/mL)，V1為蘋果原花色素提取液加入量(mL)，V2為吸附后濾液體積(mL)，V3為解吸液體積(mL)。

1.2.5 蘋果原花色素分離前后對(duì)超氧陰離子的清除作用

向按最佳提取工藝條件提取的蘋果原花色素提取液和AB-8樹(shù)脂吸附后經(jīng)50%乙醇溶液解吸后所得的蘋果原花色素解吸液中分別加入適量蒸餾水，使其原花色素濃度均為0.015 mg/mL。然后按文獻(xiàn)[15]操作，測(cè)定經(jīng)適度稀釋后的蘋果原花色素提取液和解吸液對(duì)超氧陰離子的清除率。每組試驗(yàn)重復(fù)兩次。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果原花色素提取條件的優(yōu)化

為了確定蘋果原花色素最佳提取工藝，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了四因素三水平正交試驗(yàn)L9(34)，具體設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表1，極差分析見(jiàn)表2。由表1和表2可知，影響蘋果原花色素提取率的因素主次排序?yàn)椋阂掖紳舛?提取溫度>料液比>提取時(shí)間。根據(jù)k值判斷，蘋果原花色素的最佳提取工藝為A2B1C2D2，即乙醇濃度40%、料液比1∶7 g/mL、提取時(shí)間80 min、提取溫度60 ℃，在此條件下進(jìn)行試驗(yàn)，蘋果原花色素提取率為0.051%，高于所有正交試驗(yàn)組合的提取率，故確定通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的條件為蘋果原花色素的最佳提取工藝條件。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2 正交試驗(yàn)極差分析

2.2 三種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)蘋果原花色素靜態(tài)吸附與解吸效果比較

三種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)蘋果原花色素靜態(tài)吸附及不同濃度乙醇溶液靜態(tài)解吸蘋果原花色素的結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，三種大孔吸附樹(shù)脂中AB-8對(duì)蘋果原花色素的吸附效果最強(qiáng)，HPD100對(duì)蘋果原花色素的吸附效果最弱，但吸附率接近，這可能與原花色素及三種樹(shù)脂的極性有關(guān)。原花色素是多酚類化合物，具有較弱的極性；而AB-8樹(shù)脂呈弱極性，D101和HPD100為非極性樹(shù)脂，三種樹(shù)脂極性相近，所以AB-8樹(shù)脂對(duì)蘋果原花色素的吸附效果最強(qiáng)，但不突出。從解吸效果看，50%乙醇溶液對(duì)AB-8樹(shù)脂吸附的蘋果原花色素解吸效果最好，解吸率達(dá)65.57%。考慮到樹(shù)脂不僅要具有較強(qiáng)的吸附能力，還需要易解吸，因此采用AB-8樹(shù)脂對(duì)蘋果原花色素提取液中的原花色素進(jìn)行吸附，然后以50%乙醇溶液進(jìn)行解吸，解吸液中的蘋果原花色素含量可達(dá)0.027 mg/mL。

表3 三種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)蘋果原花色素靜態(tài)吸附與解吸結(jié)果

2.3 蘋果原花色素分離前后對(duì)超氧陰離子的清除作用

蘋果原花色素經(jīng)AB-8樹(shù)脂分離前后對(duì)超氧陰離子的清除效果見(jiàn)表4。由表4可以看出，兩種溶液中的蘋果原花色素的濃度一致，但0.015 mg/mL的解吸液對(duì)超氧陰離子的清除率可達(dá)35.21%，較0.015 mg/mL的提取液對(duì)超氧陰離子的清除率有大幅度提高。這說(shuō)明蘋果原花色素提取液經(jīng)過(guò)AB-8樹(shù)脂分離后，去除了部分雜質(zhì)，減少了雜質(zhì)對(duì)蘋果原花色素抗氧化作用的影響，通過(guò)分離可以顯著提高蘋果原花色素的抗氧化作用。

表4 蘋果原花色素分離前后對(duì)超氧陰離子的清除率

3 結(jié)論

以去皮蘋果為原料，通過(guò)試驗(yàn)確定乙醇溶液提取蘋果原花色素的最佳工藝條件為：乙醇濃度40%、料液比1∶7 g/mL、提取時(shí)間80 min、提取溫度60 ℃，在此條件下進(jìn)行試驗(yàn)，蘋果原花色素提取率為0.051%。通過(guò)極差分析發(fā)現(xiàn)，影響蘋果原花色素提取率的因素主次排序?yàn)椋阂掖紳舛?提取溫度>料液比>提取時(shí)間。通過(guò)D101、AB-8、HPD100等三種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)蘋果原花色素進(jìn)行靜態(tài)吸附及采用不同濃度乙醇溶液進(jìn)行靜態(tài)解吸的比較，發(fā)現(xiàn)AB-8樹(shù)脂對(duì)蘋果原花色素提取液中的原花色素吸附效果最好，吸附率達(dá)79.36%；然后以50%乙醇溶液進(jìn)行解吸，解吸率可達(dá)65.57%，解吸液中的蘋果原花色素含量可達(dá)0.027 mg/mL。此外，通過(guò)測(cè)定0.015 mg/mL的蘋果原花色素解吸液和蘋果原花色素提取液對(duì)超氧陰離子的清除率發(fā)現(xiàn)，0.015 mg/mL的蘋果原花色素解吸液對(duì)超氧陰離子的清除率可達(dá)35.21%，清除效果較蘋果原花色素提取液明顯提高，說(shuō)明通過(guò)分離可以加強(qiáng)蘋果原花色素的抗氧化作用。