王 平 羅君琴 聶振朋 柯甫志 徐建國

（浙江省柑橘研究所/國家品種改良分中心 臺州318026）

三倍體材料因其果實(shí)無籽、抗性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而倍受育種工作者的青睞。柑橘三倍體小種子是由于二倍體母本在雜交過程中產(chǎn)生不完全減數(shù)的配子而形成，其在柑橘二倍體雜交后代中普遍存在，是選育柑橘可遺傳三倍體材料的一個重要途徑[1～3]。但小種子胚弱，自然播種萌發(fā)率極低，需要通過組培技術(shù)提高植株再生率[4]。本研究以多籽凱旋柑品種為材料，利用流式細(xì)胞術(shù)快速篩選出三倍體組培苗，為進(jìn)一步改良多籽柑橘品種、豐富柑橘三倍體種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

自然授粉的凱旋柑成熟果實(shí)晴天采摘于浙江省柑橘研究所山站試驗(yàn)園，剔除病蟲害果、畸形果后室溫放置。隨機(jī)挑選50個果實(shí)進(jìn)行小種子重量和出現(xiàn)頻率統(tǒng)計。

1.2 小種子組培成苗技術(shù)體系

在無菌環(huán)境下，凱旋柑整果用消毒刀繞橫徑切1圈，扭成兩半，用滅過菌的鑷子挑出小種子，75%乙醇溶液滅菌處理10 min，再用無菌水清洗一次，去除種皮后分類選出中粒小種子種胚、小粒小種子種胚、中粒癟籽種胚和小粒癟籽種胚，接種于含0.5mg/L KT+0.5mg/L IBA 激素組合的培養(yǎng)基，在溫度24±2℃、光強(qiáng)2000Lux、光照時間12h/d的模擬光照條件下培養(yǎng)成苗。

1.3 倍性鑒定

組培苗倍性鑒定采用流式細(xì)胞術(shù)法，檢測儀器采用CyFlow?Space PARTEC 流式細(xì)胞儀，檢測試劑采用CyStain UV Precise T（Sysmex Partec公司）試劑盒。

剪取組培苗嫩葉置于培養(yǎng)皿中，先加0.4ml 提取液置于葉片表面，用刀片切碎葉片并靜置培養(yǎng)30s，過濾出液體，再加1.6 ml DNA染色液待測用。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型種子出現(xiàn)頻率分析

對隨機(jī)選取的50 個果實(shí)種子進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果（表1）顯示自然授粉的凱旋柑平均每果種子多達(dá)10顆以上，小種子重量均在正常種子的1/3 以下，平均每個果實(shí)中出現(xiàn)0.84 顆小種子。為區(qū)分小種子大小與倍性的相關(guān)性，進(jìn)一步將小種子分為中粒和小粒兩類進(jìn)行研究，其中小粒種子均重在正常種子的1/6 以下。由于三倍體種胚弱小，極易發(fā)育不良，試驗(yàn)同時對癟籽進(jìn)行組培成苗并倍性鑒定，且根據(jù)種胚大小分為中粒癟籽和小粒癟籽兩類。不同種子類型如圖1所示。

圖1. 自然授粉凱旋柑果實(shí)的不同類型種子

表1 不同類型種子的出現(xiàn)頻率、重量和比值

2.2 小種子/癟籽種胚組培成苗及其三倍體概率統(tǒng)計

對2017年份凱旋柑小種子//癟籽種胚成苗植株進(jìn)行倍性鑒定并統(tǒng)計三倍體出現(xiàn)概率（如表2）。2017年份通過組培技術(shù)途徑共獲得467 棵小種子組培苗和89 棵癟籽組培苗，利用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測篩選出276 株小種子三倍體組培苗和13 株癟籽三倍體組培苗，三倍體總概率達(dá)到52..3%。對不同類型的小種子//癟籽的倍性進(jìn)行了分類統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)中粒小種子和小粒小種子里三倍體概率極為相似，均接近60%%；而癟籽三倍體出現(xiàn)概率較低，平均概率為23..4%，其中中粒癟籽的三倍體概率最低（不足10%%）。按小種子三倍體概率計算，自然授粉的凱旋柑三倍體小種子可達(dá)0.48顆/果。

3 小結(jié)與討論

本研究中，凱旋柑為單胚品種，其小種子的重量均在正常種子的1/3 以下，甚至小到1/6，這 與 陳 力 耕 和 胡 運(yùn) 權(quán)[1]、Esen 和Soost[5]的研究結(jié)果一致。Aleza 等[4]發(fā)現(xiàn)三倍體小種子的產(chǎn)生頻率與母本的遺傳型密切相關(guān)，其中Fortune 為母本的雜交后代小種子三倍體概率極高，每果能培養(yǎng)出2.54株三倍體再生植株，而其它5 個為母本的概率在0.12～0.32 株/果。本試驗(yàn)中，自然授粉的凱旋柑品種每個果實(shí)可培養(yǎng)出0.48 株三倍體再生植株，產(chǎn)生概率處于中高水平。本研究結(jié)果再次驗(yàn)證了基于組培技術(shù)的三倍體小種子培育是選育無核柑橘材料的一個有效途徑。

表2 凱旋柑小種子/癟籽組培苗倍性概率統(tǒng)計