鄧心怡，顧建英

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院整形外科，上海 200032

腫瘤治療向來(lái)是醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)，面對(duì)手術(shù)切除、放化療等傳統(tǒng)治療手段效果不理想的腫瘤，近年基于分子生物學(xué)及免疫學(xué)發(fā)展起來(lái)的細(xì)胞免疫治療有望成為一種新的強(qiáng)有力的抗腫瘤手段，而嵌合抗原受體T細(xì)胞(CAR-T細(xì)胞)免疫療法也研究熱點(diǎn)之一。通過(guò)基因工程技術(shù)對(duì)T淋巴細(xì)胞進(jìn)行修飾，使其表面能表達(dá)嵌合抗原受體。這種受體使細(xì)胞不依賴主要組織相容性復(fù)合體及抗原提呈細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原的識(shí)別和呈遞過(guò)程，自身直接識(shí)別腫瘤蛋白質(zhì)及脂類抗原，這一特性使其對(duì)腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的靶向識(shí)別能力?，F(xiàn)階段CAR-T細(xì)胞在臨床上主要用于治療急性B淋巴細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、非霍奇金淋巴瘤等血液系統(tǒng)惡性腫瘤[2]。鑒于CAR-T細(xì)胞療法在血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療中的優(yōu)秀表現(xiàn)，科學(xué)家們也逐漸將研究目光轉(zhuǎn)向CAR-T細(xì)胞在黑素瘤等實(shí)體腫瘤治療的運(yùn)用。雖然目前關(guān)于CAR-T細(xì)胞療法在實(shí)體腫瘤中運(yùn)用的研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也暴露出，將CAR-T細(xì)胞療法作為一種實(shí)體腫瘤標(biāo)準(zhǔn)治療方案尚有相當(dāng)多的困難需要克服。

1 CAR-T細(xì)胞

1.1 CAR-T細(xì)胞的特性與機(jī)制 CAR-T細(xì)胞的功能結(jié)構(gòu)大致由三個(gè)部分組成，包括胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域[3]。胞外結(jié)構(gòu)域?yàn)橐粋€(gè)單鏈可變片段(scFv)，該片段來(lái)源于腫瘤特異性抗原的單克隆抗體，對(duì)于特定的腫瘤抗原具有較好的靶向識(shí)別作用?？缒そY(jié)構(gòu)域?yàn)橐粋€(gè)共刺激結(jié)構(gòu)域，其中可含有如CD4、CD7、CD8、CD28和CD3ζ等蛋白分子[1]。胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域?yàn)橐粋€(gè)T細(xì)胞免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAMs)，發(fā)揮了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，將胞外信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi)。隨著研究的深入，至今已發(fā)展出四代CAR-T細(xì)胞，它們的結(jié)構(gòu)大多遵循此模式，其區(qū)別主要在于：第一代CAR-T細(xì)胞的胞內(nèi)僅有一個(gè)活化基序，而第二代和第三代CAR-T細(xì)胞分別在活化基序上添加了一個(gè)和兩個(gè)共刺激信號(hào)分子，使CAR-T細(xì)胞識(shí)別、活化和抗腫瘤能力的能力得到增強(qiáng)。而第四代CAR-T細(xì)胞還在上述結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上增加了至少一個(gè)用于編碼嵌合抗原受體及其啟動(dòng)子的載體，這樣就可以使CAR-T細(xì)胞激活的同時(shí)產(chǎn)生大量有活性的細(xì)胞因子，達(dá)到調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境、增強(qiáng)腫瘤殺傷能力的目的。此種設(shè)計(jì)賦予了T細(xì)胞直接識(shí)別腫瘤特異性抗原并自主激活的能力，因此不再依賴主要組織相容性復(fù)合體分子及抗原提呈細(xì)胞對(duì)抗原的呈遞作用。在與腫瘤細(xì)胞接觸后，CAR-T細(xì)胞即可釋放大量顆粒酶、穿孔素、腫瘤壞死因子等，對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行高效殺傷。

1.2 CAR-T細(xì)胞的優(yōu)勢(shì) CAR-T細(xì)胞的這種結(jié)構(gòu)使之同時(shí)具備了細(xì)胞免疫和體液免疫的特點(diǎn)，大大提高了其抗腫瘤效率。大量臨床試驗(yàn)及運(yùn)用實(shí)例表明，CAR-T細(xì)胞主要具有以下優(yōu)勢(shì)：①特異性高：CAR-T細(xì)胞表面單鏈可變片段(scFv)的設(shè)計(jì)源自腫瘤特異性抗原單克隆抗體，因此可通過(guò)抗原-抗體識(shí)別機(jī)制，準(zhǔn)確識(shí)別腫瘤細(xì)胞，有效減少腫瘤免疫逃逸現(xiàn)象[4]。②靶向性強(qiáng)：CAR-T細(xì)胞的結(jié)構(gòu)賦予其靶向識(shí)別腫瘤特異性抗原的能力，而這些特異性抗原通常情況下并不在正常細(xì)胞表面表達(dá)，因此CAR-T細(xì)胞能對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行“精確打擊”。③效率高：CAR-T細(xì)胞不需要經(jīng)過(guò)抗原呈遞細(xì)胞，并且不依賴MHC對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別[5]，直接識(shí)別腫瘤抗原與之結(jié)合，省去了抗原提呈的步驟，大大提高抗腫瘤效率。④覆蓋面廣泛：同起源的腫瘤細(xì)胞表面往往表達(dá)有相同或近似的腫瘤抗原，因此針對(duì)某一特定腫瘤抗原的CAR-T細(xì)胞構(gòu)建完成后便可用于多種表達(dá)同一腫瘤抗原的腫瘤的治療，“一藥多用”使得治療效率大大提高。⑤持久性好：CAR-T細(xì)胞基于T細(xì)胞進(jìn)行編輯，保留了T細(xì)胞增殖活性，輸入體內(nèi)后可大量增殖并形成記憶T細(xì)胞長(zhǎng)期存在，因此可在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持對(duì)腫瘤細(xì)胞的持續(xù)性殺滅作用。⑥可改變腫瘤微環(huán)境：有研究[6]提示，CAR-T細(xì)胞可抑制腫瘤微環(huán)境中相關(guān)抑制性細(xì)胞的功能，明顯減少免疫抑制性細(xì)胞因子的分泌，改變腫瘤微環(huán)境，易于腫瘤殺傷性細(xì)胞的后續(xù)進(jìn)入，并抑制腫瘤的增殖，間接增強(qiáng)了其殺滅腫瘤的能力。

2 CAR-T細(xì)胞的運(yùn)用

CAR-T細(xì)胞療法是一種具有特異性的過(guò)繼性免疫效應(yīng)細(xì)胞治療方法，與傳統(tǒng)腫瘤治療方案如手術(shù)切除治療及放化療相比，CAR-T細(xì)胞治療具有更精確的靶向性，殺傷腫瘤組織的時(shí)，對(duì)正常組織的損傷更小，腫瘤殺傷效果維持時(shí)間更久等明顯優(yōu)勢(shì)?；贑AR-T細(xì)胞的諸多優(yōu)勢(shì)，CAR-T細(xì)胞療法有潛力成為一種新的腫瘤治療模式。隨著研究的深入，CAR-T細(xì)胞結(jié)構(gòu)不斷得到優(yōu)化，現(xiàn)已開(kāi)發(fā)出四代CAR-T細(xì)胞，并開(kāi)始將其逐步運(yùn)用于臨床試驗(yàn)和治療[7]。

2.1 CAR-T細(xì)胞在血液惡性腫瘤中的運(yùn)用 CAR-T細(xì)胞的臨床試驗(yàn)首先在血液惡性腫瘤中展開(kāi)。Rosenberg課題組[8]在2010年發(fā)表了首篇關(guān)于CAR-T細(xì)胞的臨床治療結(jié)果，該研究提示，通過(guò)注射抗CD19分子的CAR-T細(xì)胞，晚期濾泡淋巴瘤患者的腫瘤負(fù)荷明顯消退，獲得了較長(zhǎng)時(shí)間的部分緩解。隨后，我國(guó)團(tuán)隊(duì)[9]也于2015年至2016年嘗試采用CD19-CAR-T細(xì)胞治療了64例難治性復(fù)發(fā)B淋巴細(xì)胞急性白血病患者，取得了良好治療效果?；诹己玫呐R床治療反饋，各大生物公司開(kāi)始研發(fā)CAR-T細(xì)胞抗腫瘤藥物，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局于2017年受理了諾華和凱特制藥兩個(gè)公司關(guān)于CAR-T療法的申請(qǐng)，授予其“突破性療法”地位，緊接著，全球第一個(gè)CAR-T細(xì)胞療法上市。該療法早期主要運(yùn)用于淋巴瘤及白血病的治療，基于良好的治療反饋，近年來(lái)也開(kāi)始嘗試將其用于如黑素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等實(shí)體性腫瘤的臨床試驗(yàn)中。

2.2 CAR-T細(xì)胞在黑素瘤中的運(yùn)用 黑素瘤是一種中外胚層神經(jīng)嵴來(lái)源的黑素細(xì)胞的高度惡性腫瘤，預(yù)后差、治療難度大。以往多采用手術(shù)切除治療，但黑素瘤轉(zhuǎn)移較早，轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者預(yù)后極差。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移黑素瘤患者十年生存率尚不足10%[10]。

黑素瘤細(xì)胞攜帶有大量的突變基因序列，其細(xì)胞表面表達(dá)有大量腫瘤新抗原，這一特性使之容易被免疫系統(tǒng)所識(shí)別?；诖颂卣鳎茖W(xué)家們很早便開(kāi)始在黑素瘤的治療中嘗試應(yīng)用免疫療法[11]，且取得了不錯(cuò)的療效。鑒于CAR-T細(xì)胞在治療血液惡性腫瘤的嘗試中表現(xiàn)優(yōu)異，科學(xué)家們開(kāi)始將研究目光轉(zhuǎn)向黑素瘤的治療。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院癌癥研究所癌癥研究中心外科分會(huì)于2006年進(jìn)行了一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究[12]，使用反轉(zhuǎn)錄病毒改造正常的循環(huán)中的淋巴細(xì)胞，使其表達(dá)識(shí)別黑素瘤分化抗原 (melanoma antigen recognized by T cells 1，MAR T1)的TCR，將此種細(xì)胞回輸入患者體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)能夠有效介導(dǎo)腫瘤的消退。2014年Christian Krug等[13]以黑素瘤相關(guān)硫酸軟骨素蛋白多糖(Melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan，MCSP)作為治療靶點(diǎn)，構(gòu)建并鑒定了第1、2兩代CAR-T細(xì)胞。其抗腫瘤活性鑒定結(jié)果提示，兩代CAR-T細(xì)胞均可有效殺傷黑素瘤細(xì)胞?；己谒亓鲂∈蠼?jīng)過(guò)輸注CAR-T細(xì)胞，生存期得到了明顯的延長(zhǎng)，且此效果在第2代CAR-T細(xì)胞中表現(xiàn)得更為顯著。之后在2017年，一項(xiàng)由Efrat等發(fā)起的的關(guān)于運(yùn)用過(guò)繼細(xì)胞療法(ACT)治療惡性黑素瘤的研究[14]顯示：通過(guò)回輸VEGFR2-CAR-T細(xì)胞而接受過(guò)繼細(xì)胞療法的24名患者中，緩解率為4%。一系列實(shí)驗(yàn)研究表明，CAR-T細(xì)胞過(guò)繼細(xì)胞免疫療法對(duì)于黑素瘤有極大的治療潛力，但目前仍存在一些不可忽視的問(wèn)題阻礙著此療法的臨床運(yùn)用。

3 CAR-T細(xì)胞療法治療黑素瘤面臨的問(wèn)題及對(duì)策

CAR-T細(xì)胞在腫瘤殺傷中所表現(xiàn)出來(lái)的各種優(yōu)勢(shì)，使之成為腫瘤治療方面的研究熱點(diǎn)，被認(rèn)為是腫瘤治療的新方向。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，血液系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞表面攜帶大量腫瘤特異性抗原便于CAR-T細(xì)胞的識(shí)別，無(wú)屏障作用的循環(huán)系統(tǒng)使得CAR-T細(xì)胞能夠迅速擴(kuò)散及分布，以及T淋巴細(xì)胞的歸巢效應(yīng)，這些特性賦予CAR-T細(xì)胞在治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的運(yùn)用中的巨大優(yōu)勢(shì)。雖然科學(xué)家已經(jīng)過(guò)諸多嘗試，然而目前CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體腫瘤如黑素瘤仍存在許多障礙[14]。

3.1 趨化過(guò)程中的物理障礙 黑素瘤為實(shí)體性腫瘤，與血液系統(tǒng)腫瘤無(wú)屏障作用不同，腫瘤微環(huán)境形成的物理屏障對(duì)CAR-T細(xì)胞是一種阻礙。CAR-T細(xì)胞需要從血管中移出，跨越內(nèi)皮屏障[16]，遷徙至病灶處，隨后需要分泌降解酶，主動(dòng)降解細(xì)胞外基質(zhì)[17]以到達(dá)并接觸腫瘤細(xì)胞。以往回輸CAR-T細(xì)胞多通過(guò)靜脈注射，而對(duì)于黑素瘤而言，腫瘤處病灶內(nèi)注射[18]可有效避免上述物理障礙。另外有研究者設(shè)計(jì)出表達(dá)相應(yīng)細(xì)胞因子受體的CAR-T細(xì)胞，使之利用“歸巢”效應(yīng)定位并遷徙至腫瘤細(xì)胞所在部位[19]。

3.2 腫瘤微環(huán)境的免疫抑制 實(shí)體腫瘤存在腫瘤微環(huán)境，這是CAR-T細(xì)胞面臨的最重要的障礙之一。腫瘤微環(huán)境中存在的基質(zhì)細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)等營(yíng)造了免疫抑制環(huán)境，CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤活性在其中將受到抑制。賓夕法尼亞大學(xué)的一個(gè)研究小組報(bào)道了一種利用免疫抑制細(xì)胞因子來(lái)規(guī)避此影響的策略，他們使CAR-T細(xì)胞表達(dá)dnTGF-β受體，通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，這一措施可增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的存活、分泌細(xì)胞因子及腫瘤殺傷的能力[20]。

3.3 腫瘤的免疫逃逸 接受CAR-T細(xì)胞治療的患者在最初有效的治療反應(yīng)后，可能會(huì)出現(xiàn)腫瘤的進(jìn)展，這很可能是由于腫瘤細(xì)胞啟動(dòng)了“免疫逃逸機(jī)制”，繞過(guò)了現(xiàn)有的免疫識(shí)別系統(tǒng)所導(dǎo)致[21]。這些機(jī)制包括靶抗原的下調(diào)或丟失。黑素瘤為一種高度異質(zhì)性腫瘤，因此識(shí)別單一腫瘤抗原的CAR-T細(xì)胞很容易在使用一段時(shí)間后出現(xiàn)“脫靶”現(xiàn)象。因此有研究者提出，使CAR-T細(xì)胞同時(shí)表達(dá)2種腫瘤特異性受體的方法來(lái)應(yīng)對(duì)此現(xiàn)象[22]。構(gòu)建串聯(lián)CAR 體系(“tandem” CAR，TanCAR)可以降低腫瘤抗原逃逸的概率，如構(gòu)建表達(dá)HER2抗體和IL13Rα2抗體的CAR-T細(xì)胞，單個(gè)HER2或IL13Rα2就能激活TanCAR，當(dāng)兩種抗原同時(shí)被識(shí)別時(shí)則能夠產(chǎn)生更強(qiáng)的活性，TanCAR-T細(xì)胞能有效增強(qiáng)T細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)，減少腫瘤復(fù)發(fā)[23]。

3.4 治療相關(guān)毒性作用 CAR-T治療的毒性作用主要分為腫瘤靶向毒性和非腫瘤/靶向毒性。腫瘤靶向毒性產(chǎn)生的機(jī)制主要是，CAR-T細(xì)胞經(jīng)回輸大量增殖，迅速識(shí)別殺傷腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)炎性細(xì)胞因子短時(shí)間內(nèi)大量釋放，即引起細(xì)胞因子釋放綜合征(cytokine-release syndrome，CRS)。同時(shí)，腫瘤細(xì)胞大量溶解，細(xì)胞內(nèi)離子釋放入內(nèi)環(huán)境，造成以高鉀、高磷、高尿酸等癥狀為主的腫瘤溶解綜合征(tumor lysis syndrome，TLS)。對(duì)于靶向毒性，主要有如下幾種對(duì)應(yīng)方法[5]：①設(shè)計(jì)CAR時(shí)加入可控性自殺基因作為安全開(kāi)關(guān)；②優(yōu)化CAR-T細(xì)胞回輸方案，由少量逐漸過(guò)渡，緩慢增加回輸量；③先回輸少量1代CAR-T細(xì)胞，待機(jī)體適應(yīng)后改用2代或3代CAR-T細(xì)胞增強(qiáng)抗腫瘤效果；④回輸CAR-T細(xì)胞的同時(shí)注射免疫抑制劑，白細(xì)胞介素1、白細(xì)胞介素6等細(xì)胞因子的拮抗劑能有效防止CRS及緩解已發(fā)生的CRS。

非腫瘤/靶向毒性的產(chǎn)生機(jī)制為，CAR-T細(xì)胞依賴腫瘤表面抗原發(fā)揮作用，而它所識(shí)別的腫瘤抗原往往不僅表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面，某些正常細(xì)胞表面也可能有不同程度的表達(dá)，因此CAR-T細(xì)胞識(shí)別腫瘤抗原時(shí)有可能出現(xiàn)誤差，對(duì)健康組織也造成損傷。要解決此類問(wèn)題，就需要發(fā)現(xiàn)特異性更高的腫瘤表面抗原。

4 總結(jié)與展望

作為一種新型過(guò)繼性免疫細(xì)胞療法，CAR-T細(xì)胞療法通過(guò)數(shù)十年的研究已經(jīng)逐步成熟，目前在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療中已取得顯著成效，且已經(jīng)開(kāi)始了較廣泛的臨床使用。通過(guò)上述總結(jié)，CAR-T具有高效準(zhǔn)確及長(zhǎng)期維持等優(yōu)點(diǎn)，是否可將其用于黑素瘤等實(shí)體腫瘤的治療是目前的研究熱點(diǎn)，鑒于其在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的優(yōu)秀表現(xiàn)，其治療實(shí)體腫瘤的潛力不容小覷。但現(xiàn)階段存在的諸多障礙，如腫瘤微環(huán)境的物理屏障作用，腫瘤的抗原下調(diào)導(dǎo)致脫靶效應(yīng)，非腫瘤細(xì)胞的錯(cuò)誤識(shí)別，治療相關(guān)的毒性反應(yīng)等仍待進(jìn)一步的研究以克服。相信在不遠(yuǎn)的未來(lái)，CAR-T細(xì)胞過(guò)繼免疫療法將更加成熟，有望成為新一代強(qiáng)有力的抗腫瘤手段。