甜菜褐斑病及種質資源抗性研究進展

鄒鋒康，丁廣洲，賈海倫，陳麗

（1.黑龍江省甜菜工程技術研究中心/黑龍江大學，哈爾濱150080；2.國家糖料改良中心/黑龍江大學，哈爾濱150080；3黑龍江省高校甜菜遺傳育種重點實驗室，哈爾濱150080）

0 引言

甜菜（Beta vulgarisL.）是當今世界種植面積僅次于甘蔗的糖料作物，是世界主要的制糖原料之一，提供著世界上大約25%的蔗糖需求[1]。甜菜褐斑?。–ercosporaleaf spots，CLS）是由甜菜尾孢菌（Cercospora beticolaSacc.）引起的真菌病，是影響甜菜產量的一種世界性病害，在各甜菜種植國均有發(fā)生。為了控制甜菜褐斑病的發(fā)生，國內外科學家做了大量的研究工作，如：Vaghef等發(fā)表了甜菜尾孢菌種群的多樣性、致病性和進化物種界限[2]。Piszczek等報道波蘭甜菜尾孢菌對化學藥物的抗性增強[3]。Mahdi Arzanlou等發(fā)現(xiàn)尾孢菌拮抗菌可以抵抗尾孢菌病害[4]。Kazunori等利用復合區(qū)間作圖發(fā)現(xiàn)了4個與CLS抗性相關的QTL[5]。王茂芊等對國內外18個甜菜品種做了根腐病和褐斑病抗性鑒定[6]。丁廣洲等對甜菜褐斑病抗感種質細胞超微結構變化進行了比較[7]。楊安沛等進行了不同甜菜品種對褐斑病的抗性分析[8]。前人還對褐斑病菌及褐斑病發(fā)病機制[9]，褐斑病菌的抗藥性[10]和甜菜對褐斑病抗性[11]的研究動向分別做了總結。為了使人們更加清晰完整地了解近些年科學家對甜菜褐斑病的研究現(xiàn)狀。本文綜述了甜菜褐斑病菌的分類及其形態(tài)特征；褐斑病的發(fā)生、防治及致病機理；尾孢菌的抗藥性；甜菜對褐斑病的抗性；甜菜抗褐斑病的遺傳研究，以期為甜菜褐斑病的抗性研究和防治提供理論參考。

1 甜菜褐斑病菌的分類及形態(tài)特征

甜菜褐斑病菌為真菌界，半知菌亞門，不完全菌綱，叢梗孢目，尾孢科，甜菜尾孢菌屬[12]。在屬的分類上甜菜尾孢菌比較混亂[13]，原因可能是甜菜尾孢菌沒有已知的端粒形態(tài)和菌絲連接及難以捉摸的交配系統(tǒng)。甜菜尾孢菌菌絲體基質發(fā)育不健全，直徑達60 μm，內表皮或亞表皮層為棕色至深棕色。分生孢子梗2～18枚，束狀，稍發(fā)散，棕色，頂端變淺，中等厚壁，圓柱形，寬度基本一致，簡單，膝狀，16～200 μm×4～6 μm，1～6隔，頂端截形，有時隔膜處收縮。分生孢子的細胞頂生或具有間隔，增殖合生，具1～2個位點；位點處明顯增厚，不突起，頂端或分生細胞肩胛的形成是由膝狀體外側引起的，2.5～3 μm。分生孢子，絲狀至針狀，中等彎曲，很少具圓柱狀，在基部截形，頂端銳尖至亞急狀，27～250 μm×2～5 μm，3～28分隔[14]。

2 甜菜褐斑病的發(fā)生及其危害

甜菜尾孢菌在無性狀態(tài)下，以假基質的形式在受感染的植物碎片上越冬，并通過雨水的飛濺使分生孢子短距離傳播[15]。其可從甜菜葉片兩側對葉片進行侵染。其侵染過程分為兩類：一種為附著在葉片表面的尾孢菌分生孢子或分生孢子分支通過植物氣孔開口進入植物細胞間隙，在細胞間隙中吸取植物組織中營養(yǎng)，不斷生長形成菌絲團，同時分泌一些有害物質對周圍植物組織細胞造成破壞，使組織塌陷，形成褐色斑點[16]；另一種為分生孢子破壞細胞表皮對植物細胞進行侵染,在細胞表皮下，分生孢子產生大量短細胞，短細胞在細胞間隙不斷生長破壞周圍細胞，造成組織細胞塌陷，形成棕色斑點[16]。

在溫度20℃左右，濕度70%以上，無風條件下甜菜褐斑病容易發(fā)病。在每年6月下旬到7月上旬開始發(fā)病，7月到8月為盛期，9月中旬停止蔓延[17]。發(fā)病由老葉開始，然后是幼葉。發(fā)病初期在葉部表現(xiàn)為葉表面出現(xiàn)很多針尖大小的褐色小斑點，之后斑點逐漸擴大，呈圓形、橢圓形或不規(guī)則的輪廓，最后，葉片病斑連成大片，造成葉片的干枯脫落。在一般年份，該病可造成甜菜塊根減產10%～20%，含糖降低1～2度，葉莖損失40%～70%[18]。

3 甜菜褐斑病的防治

目前，還沒有育出完全抗褐斑病的甜菜品種，甜菜褐斑病仍然是影響甜菜產量的一個重要因素。人類對甜菜褐斑病的防治措施主要包括：褐斑病的早期鑒定、生物防治和化學防治。

3.1 褐斑病鑒定

褐斑病鑒定是預防褐斑病發(fā)生的一個重要手段。以前鑒定是通過肉眼觀察鑒定評價的，這種方法對褐斑病早期侵染無法識別，對中期染病級別判斷不準確，且具有一定的主觀性。隨著科學技術的不斷發(fā)展，分子鑒定和生理指標鑒定逐漸走向成熟，其以快速、靈敏、準確的優(yōu)勢逐漸代替了肉眼鑒定。目前褐斑病鑒定的方法有：Andreea-Mihaela BALAU等[19]以聚合酶鏈反應（PCR）為基礎，提出了一種鑒定甜菜尾孢菌早侵染的方法。該方法把甜菜葉片DNA純化后，將勻漿中的片段加入到PCR反應中，并利用尾孢菌基因特異性進行擴增。擴增產物的片段大小與從尾孢菌培養(yǎng)物中提取的DNA片段大小相關聯(lián)，以鑒定真菌。Rumpf等[20]建立了一種基于支持向量機和光譜植被指標的甜菜褐斑病早期檢測和鑒別的方法，對甜菜健康葉片和病葉的分類準確率達到了97%。Arens等[21]研究表明高光譜成像對甜菜褐斑病感染預測準確率可達到98.5%～99.9%。Lartey等[22]提出了一個快速檢測甜菜組織中甜菜尾孢菌的PCR方法。Bma[23]等用圖像分析軟件和實時PCR方法，對甜菜不同階段褐斑病病變和病菌生物量進行定量檢測，該方法可用于褐斑病早期感染的鑒定和評估，為高效準確鑒定褐斑病提供了一種手段。Leucker[24-25]等和Roscher[26]等研究表明高光譜成像能通過客觀、精確的植物表型鑒定，快速可靠地區(qū)分CLS的動態(tài)和病變。RongZhou等[27]研究表明魯棒模板匹配和模式識別技術可以對田間甜菜葉斑病進行監(jiān)測。

3.2 生物防治

生物防治是利用生物間的拮抗作用防治目標病害的一種方法。其簡單、高效、對環(huán)境友好且對病害的控制成本較低，是病害防治的綠色良藥。目前對甜菜褐斑病生物防治的研究已開展的較多了，Mahdi Arzanlou等[4]研究發(fā)現(xiàn)，尾孢菌拮抗菌可明顯降低褐斑病的危害程度。史應武等[28]研究發(fā)現(xiàn)，多粘芽孢桿菌對甜菜褐斑病有抑制作用，且對甜菜的生長有促進作用。Douglas PCollins等[29]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌可以降低甜菜褐斑病的發(fā)病程度。AMH Esh等[30]從甜菜葉球中分離出16株淀粉酶芽孢桿菌，利用其對甜菜褐斑病病原-甜菜尾孢菌的拮抗活性進行了研究，結果表明，該菌株對甜菜褐斑病菌有明顯的拮抗作用，對甜菜褐斑病菌徑向生長的抑制率為77.8%～90%。S Galletti等[31]研究發(fā)現(xiàn)，木霉可減少尾孢菌的發(fā)生和孢子的產生，可作為甜菜褐斑病的生物防治劑。Caesar-Tonthat等[32]研究表明，擔子菌真菌能降低尾孢菌素對微生物和植物組織的毒性作用。El-Fawy[33]研究發(fā)現(xiàn)青霉對尾孢菌有抑制作用，其抑制作用與粘合劑濃度有關。

3.3 化學防治

化學防治是目前最普遍、有效的方法。目前甜菜褐斑病防治的殺菌劑有兩類：一類是保護性殺菌劑包括二硫代氨基甲酸鹽，有機錫類等；第二類是吸納性殺菌劑包括苯并咪唑類，甾醇脫甲基化酶抑制劑和甲氧基丙烯酸類等[34]。Ricardo[35]等研究發(fā)現(xiàn)，噴施殼聚糖或亞油酸-s-甲基可以降低甜菜褐斑病病害。Elkholi[36]利用氯化鈣和螯合鈣降低尾孢菌對甜菜的病害，取得顯著效果。Nielsen等[37]研究發(fā)現(xiàn)2，6-二氯異煙酸（INA）可以使甜菜防御系統(tǒng)更快地被激活，增強甜菜的抗病能力。

4 甜菜褐斑病菌的耐藥性

雖然殺菌劑在防治甜菜褐斑病發(fā)生上有很好的效果。但是，近些年人們發(fā)現(xiàn)殺菌劑的頻繁使用會導致植物病原菌的選擇性壓力和抗藥性的增強[38]。經過研究，科學家已證實尾孢菌的抗藥性。Malandrakis等[39]研究表明，甜菜尾孢菌抗性突變株降低了尾孢菌對Qo敏感性。Piszczek等[3]研究表明，波蘭甜菜尾孢菌QoI耐受性逐漸增強，所有耐藥菌株均含有單鳥嘌呤取代(G/C)，預測甘氨酸在143個密碼子位置（G143A）可轉化為丙氨酸。Budakov等[40]對塞爾維亞甜菜尾孢菌進行耐藥性研究。研究表明，該地的菌株對粉唑醇和多菌靈的耐藥率分別為16%和96%。且所有對粉唑醇耐藥的菌株對多菌靈也都是耐藥的。Trkulja等[41]（2008—2011）對塞爾維亞兩個地區(qū)的甜菜田使用判別濃度法，研究確定收集的93.3%～98.6%甜菜褐斑病分離菌株對MBC殺菌劑具有抗性，而6.2%～42.4%甜菜褐斑病分離菌株對DMI殺真菌劑具有抗性。Kirk等[42]研究表明，美國密歇根州和內布拉斯加州的甜菜尾孢菌對殺菌劑具有抗性。Nikou等[43]從重噴三唑醇的希臘甜菜田中分離出甜菜孢菌菌株。鑒定了兩個抗性表型，抗性因子分別為18～25和65～115。Rosenzweig等[44]研究表明，美國密歇根州的尾孢菌對對苯二酚外抑制劑（QoI）和苯并咪唑類殺菌劑有抗性。Trkulja等[45]研究發(fā)現(xiàn)尾孢菌對MBC、DMI和QoI三種殺菌劑表現(xiàn)出較強抗性。Vaghefi等[46]研究美國（紐約）甜菜分離株發(fā)現(xiàn)，f129l突變使尾孢菌獲得了中度的QoI抗性。尾孢菌的的抗藥性變異，已成為世界各甜菜種植國面臨的棘手問題。目前，主要的應對措施是幾種殺菌劑交替使用，以防止單一用藥的選擇壓下耐藥菌株的產生。Obuya等[47]研究發(fā)現(xiàn)美國中部高原區(qū)白尾孢菌對甲氧基丙烯酸酯有抗性，PCR-RFLP檢測方法能可靠、靈敏、快速檢測尾孢菌的抗藥性。

5 甜菜抗褐斑病的相關研究

5.1 甜菜對褐斑病的抗性

植物中存在多種多樣的防御機制，包括先天防御，如物理屏障和組成性表達的抗菌劑A、C、B化合物和誘導性耐藥機制如超敏反應和系統(tǒng)抗性。宿主/病原體相互作用的組織學研究揭示了病原體入侵后植物的各種防御反應[48-49]。研究表明甜菜的尾孢菌抗性可能與氣孔的開關頻率、直徑或水壓刺激的強度等特性有關[50]；甜菜受尾孢菌侵染后葉片中的酚類化合物、多酚氧化酶、過氧化物酶的活性、葡聚糖酶、胼胝體、果膠、木質素和角質蠟含量的增加[51-58]，使尾孢菌菌絲體在葉肉細胞的發(fā)育受到限制。

Hecker[59]等研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸Glu和DOPA可能與甜菜褐斑病的抗性有關。Glu可能增加易感性，DOPA可能在抗病機制中發(fā)揮作用。Johnson等[60]研究發(fā)現(xiàn)，褐斑病菌在侵染甜菜葉片時葉片3-羥基-7,8,4'-三甲氧基黃酮（C18H16O6）和黃曲霉毒素（C17H12O6）的含量升高且高抗株比敏感株含量要高。表明這兩種化合物在抗褐斑病中起重要作用。Arens等[21]研究發(fā)現(xiàn)多巴胺，12-羥基茉莉酸-12-O-尾-D-葡萄糖苷，泛酸和5-阿魏基奎尼酸和甜菜尾孢菌抗性有關。Anne等[61-62]研究發(fā)現(xiàn)甜菜細胞間抗真菌蛋白（IWF6）與甜菜褐斑病抗性有關；甜菜葉片中的非特異性脂質轉移蛋白（Nsltp）對甜菜尾孢菌有較強的抗性，在濃度低于10 μg/mL的情況下抑制真菌生長。

5.2 甜菜抗褐斑病遺傳研究

甜菜對褐斑病的抗性遺傳既有加性效應又有非加性效應。Ourazizadeh等[63]研究表明加性和非加性遺傳效應都有助于褐斑病抗性的表達，但基因的加性比非加性遺傳效應更為顯要，因為隱性基因對褐斑病的抗性有一定的控制作用。Niazian等[64]的研究也表明，加性遺傳和非加性遺傳成分對控制褐斑病的抗性都有一定的貢獻，但加性基因效應比非加性基因更重要。Lewellen等[65]研究甜菜對尾孢菌生理小種C2的遺傳特征時發(fā)現(xiàn)，甜菜對生理小種C2的抗性是由一個顯性基因決定的，抗性等位基因對生理小種C1的反應無影響。

5.3 甜菜抗褐斑病基因的研究及其QTL定位

多基因遺傳抗性的數(shù)量性狀位點（QTL）定位是分析寄主植物連鎖圖上遺傳抗性因子數(shù)量和位置的有力工具[66]。甜菜對尾孢的抗性是多基因定量控制的，形成抗性的宿主基因的確切數(shù)目仍不清楚。1970年Smith和Gaskill對甜菜褐斑病遺傳抗性的研究表明，在所使用的雜交組合中，有4～5個主要抗性基因參與了褐斑病抗性的表達[67]。Schondelmaier等[68]對甜菜抗褐斑病基因做了QTL的染色體定位。Nilsson等[69]利用110個AFLP和35個限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）標記對193個分離群體的數(shù)量性狀位點（QTL）進行了分析，研究甜菜褐斑病抗性的遺傳規(guī)律。分別在連鎖群1、2、3和9上進行復合區(qū)間定位，發(fā)現(xiàn)5個QTL，其中2個位于連鎖群3上。Schafer-Pregl等[70]在6個染色體上發(fā)現(xiàn)了7個與褐斑病相關的QTL。Setiawan等[71]利用復合區(qū)間作圖法，在Ⅲ、IV、VII和IX染色體上，發(fā)現(xiàn)了4個與褐斑病抗性相關的QTL。Koch等[72]在3個染色體上發(fā)現(xiàn)了4個與褐斑病相關的QTL。Kazunori[5]等利用復合區(qū)間作圖（Cim），在III、IV、VII、X上發(fā)現(xiàn)了4個與CLS抗性相關的QTL。Taguchi等[73]對RILs和Nils群體進行了QTL分析，并用人工接種的方法對褐斑病抗性進行檢測，從NK-310 mm-O中檢測到兩個與抗褐斑病相關的QTL。

5.4 甜菜抗褐斑病基因的克隆與利用

基因工程育種是現(xiàn)代抗病育種的一個重要手段，運用抗病基因，育種家在很多作物上都已育成了抗病性優(yōu)良的品種?？共』蚩寺∈腔蚬こ逃N的一個重要環(huán)節(jié)，只有發(fā)現(xiàn)并克隆出抗病基因我們才能培育出更加優(yōu)良的抗性品種。目前甜菜抗褐斑病基因的克隆和利用研究開展的較少：劉大麗等[74]對甜菜抗性基因AtChitinase1和AtChitinase2進行了克隆，獲得了兩個抗褐斑病基因。Upchurch等[75]以根瘤菌為載體，在甜菜中（Beta vulgarisL.）中克隆表達了基因CFP，并驗證基因CFP能增強對抗褐斑病的抗性。Kuykendall等[76]利用轉化法已經成功構建了具有抗褐斑病基因CFP的甜菜。Xin-Yu[77]等對第一代轉RIP基因甜菜的抗褐斑病性和生理特性進行了研究。結果表明，RIP基因能提高甜菜的抗褐斑病能力，對甜菜的生長和生理代謝無不良影響。Stahl等[78]利用其發(fā)明了轉基因方法產生的轉基因甜菜對褐斑病有很好的抗性。

6 展望

目前，化學藥物防治是甜菜各種植國甜菜褐斑病防治主要的手段?；瘜W藥物防治雖然成本相對較低，但是對土壤及生態(tài)環(huán)境的污染較為嚴重，影響人類的身心健康，也易加快病菌的進化速度，產生抗藥病菌。生物防治和抗病育種是防治褐斑病最為健康的防治手段。生物防治順應自然進化法則，利用物種間的拮抗作用以一種非致病生物抑制目標生物的生長，使得破壞維持在一個穩(wěn)定的范圍，在不破壞物種多樣性和和生態(tài)環(huán)境的前提下，使人們得到最大的收益?？共∮N是科學家利用傳統(tǒng)和基因工程手段，把植物與病菌長期斗爭中進化出來的抗性遺傳基因進行收集和利用，使那些抗病性低的種質抗性普遍增加。因此，生物防治和抗病育種將是未來的主要研究方向。

雖然很多科學家已經對甜菜抗褐斑病基因進行QTL定位，但是目前克隆出的抗褐斑病有效基因還很少。甜菜抗褐斑病育種需要把與褐斑病抗性有關的基因克隆出來，具體研究其在甜菜抗病過程中發(fā)揮的作用，把整個過程數(shù)字化，這樣科學家才能靈活掌握各個環(huán)節(jié)，培育出更加優(yōu)良的品種。因此，褐斑病抗性相關基因的尋找和克隆將是未來研究的重要課題。