影響RT-PCR實驗結(jié)果的因素

張鵬

（遼寧省丹東市動物疫病預(yù)防控制中心 118002）

1 樣品因素

（1）非洲豬瘟的靶器官是脾臟、淋巴結(jié)、腎臟、扁桃體，應(yīng)選取在病變和健康組織交界處采集樣品。

（2）對于腐敗動物尸體剖檢取股骨，將附著的肌肉和韌帶等全部剔除，采集骨髓。最低建議量5g。

（3）蜱可進(jìn)行核酸檢測、抗原檢測和蜱的形態(tài)學(xué)鑒定，查找豬圈的墻邊、墻縫、木質(zhì)或瓦質(zhì)的屋頂，或挖掘豬圈地面均可能找到蜱，也可查看豬體表面，采集蜱。

以上3 種是常見的非洲豬瘟檢測樣品。為盡可能減少污染，每取一個組織塊或蜱，用火焰消毒剪鑷等取樣器械，組織樣品分別放入滅菌容器內(nèi)并立即密封，做好標(biāo)記，注意防止組織間相互污染。組織樣品的處理應(yīng)在二級生物安全柜中進(jìn)行，勿使液體濺到生物安全柜中。

病毒的滅活處理應(yīng)在二級生物安全柜中進(jìn)行，將處理好的血清、全血或者研磨破碎后的組織樣品連同EP 管放入60℃水浴中，放置30min 滅活。這樣可以保證檢測樣品的純凈度，保證實驗結(jié)果真實有效。

2 人員因素

要求PCR 的實驗操作人員有很好的素質(zhì)，能嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，并能發(fā)現(xiàn)問題和解決問題。PCR 實驗的操作人員除了要做好必要的個人防護(hù)之外，還要熟悉實驗流程中容易出現(xiàn)的問題。要實行考核上崗和定期培訓(xùn)制度。

到不同的操作間時，要注意及時更換防護(hù)用品，在核酸提取室操作時，戴的一次性口罩、帽子、手套要勤換，避免污染。在擴(kuò)增室，對于頂部采光儀器要帶新的一次性PE 手套對熒光PCR 封蓋，對于底部采光的儀器要避免徒手或使用過的手套接觸熒光PCR 管底，檢測過程中使用不帶熒光物質(zhì)的一次性乳膠手套。

3 儀器因素

要選擇性能好的儀器。RT-PCR 實驗所用的大多屬于貴重儀器，熒光PCR 儀、冷凍離心機、生物安全柜、核酸提取儀，要根據(jù)儀器操作規(guī)程使用，定期維護(hù)保養(yǎng)，填寫使用和維護(hù)記錄，做好儀器狀態(tài)標(biāo)識，同時也要對實驗室的溫濕度進(jìn)行監(jiān)測記錄，避免實驗室濕度過大使儀器銹蝕。移液器要定期請計量部門進(jìn)行校正，各室都要有一套完整移液器，互相不能調(diào)換使用。

4 試劑因素

試劑質(zhì)量直接影響實驗結(jié)果，所以要選用高質(zhì)量的PCR 試劑。采購的試劑必須有國家正式的批準(zhǔn)文號，認(rèn)真查看試劑批號和有效期。實驗室對每批購進(jìn)的試劑要進(jìn)行校對實驗，質(zhì)量驗收合格后方可使用。

試劑盒，待檢樣品以及試驗中使用的氯仿、異丙醇等試劑要分區(qū)存放，不能存放于同一個冰箱內(nèi)，避免污染。

凍存試劑使用前應(yīng)于室溫下完全融化，瞬時離心使液體完全沉于管底，吸頭盡量在液體表層吸取，使用后立即放回-20℃。反復(fù)凍融不超過3 次，以免影響試劑性能。

5 實驗因素

（1）實驗室應(yīng)嚴(yán)格按照有關(guān)規(guī)定分區(qū)管理，依照樣品前處理區(qū)—核算制備區(qū)—擴(kuò)增區(qū)—分析區(qū)順序進(jìn)行基因檢測。各區(qū)間人員、器材、試劑及空氣流向應(yīng)有嚴(yán)格要求。

（2）核酸提取時要認(rèn)真按照試劑使用說明書一步一步進(jìn)行，防止試劑和樣品受到污染，開離心管時要用雙手，動作要輕，防止液體濺出。加樣時最后加陽性對照，減小陰性對照和樣品被污染的概率。非洲豬瘟試驗需要2 組陰陽對照：提取陽性對照（E+）、提取陰性對照（E-）、反應(yīng)陽性對照（R+）和反應(yīng)陰性對照（R-）。

（3）配液時一般要多比反應(yīng)需要的樣品數(shù)量配出2 份，由于加樣量非常小，所以加樣時，吸頭不要碰倒離心管的管壁，樣品加入后，應(yīng)在液面以下輕輕吹打幾次混勻。

（4）擴(kuò)增時用將8 連管豎直放正，確保每個管內(nèi)液體平穩(wěn)在管底，無掛壁，無氣泡。帶PE 手套操作，不能用裸手接觸管蓋或管底。實驗結(jié)束后，要將管從儀器中取出。

總之，影響RT-PCR 實驗準(zhǔn)確性的因素有很多，實驗室只有不斷提升檢測人員的能力，加強控制檢測方法和檢測過程，定期開展樣品比對實驗才能有效提高實驗的準(zhǔn)確率。