張鵬

（遼寧省丹東市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 118002）

1 注意個(gè)人防護(hù)

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程會(huì)使用到裂解液（TRIZOL）、三氯甲烷、異丙醇等化學(xué)試劑，大多對(duì)人體有害。

2 防止RNA酶的污染

（1）配液室、提取室、擴(kuò)增室、電泳室所有的器械及防護(hù)用品做到專室專用。實(shí)驗(yàn)用的手套、口罩、帽子均為一次性，手套在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要經(jīng)常更換。

（2）所有玻璃在使用前要在180℃的高溫下干烤6h以上。塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗。

（3）配置的溶液應(yīng)盡可能地用0.1%DEPC，在37℃處理12h以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑用DEPC處理過(guò)的無(wú)菌雙蒸水配置，然后經(jīng)0.22μl濾膜過(guò)濾除菌。

3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程需要注意事項(xiàng)

（1）采取水泡皮、水泡液、血液（抗凝血）、血清、組織、細(xì)胞培養(yǎng)物和口腔分泌物等樣品時(shí)，取樣的器材必須經(jīng)高壓或者干熱滅菌。分離后的樣品在2～8℃條件下保存不能超過(guò)24h，-70℃可長(zhǎng)期保存，但不能反復(fù)凍融3次。

（2）除裂解液4℃保存外，氯仿、異丙醇、75%乙醇在-20℃預(yù)冷。試驗(yàn)需在生物安全柜中進(jìn)行，每份樣本（1.5ml滅菌離心管）中加入600μl裂解液、200μl待測(cè)樣本，再加入200μl氯仿，用手顛倒混勻。于4℃12000g離心15min。在樣品數(shù)量較多時(shí)，為了避免加樣順序錯(cuò)誤，可以使移液頭和樣品的位置一一對(duì)應(yīng)，還可以使離心管的管蓋略偏向一邊，加完一份樣品之后把管蓋撥向另一邊。

（3）上清液相轉(zhuǎn)移到對(duì)應(yīng)的離心管時(shí)，可把離心管略微傾斜，在移液頭接觸到上清液面后，緩抬持移液器手的拇指，同時(shí)將移液器向下深入，當(dāng)移液頭快接觸到中間層時(shí)停止，眼睛盯住移液頭的尖部，如果發(fā)現(xiàn)有白色絮狀物進(jìn)入，拇指輕壓將其推出，然后停止吸液，這樣可以保證吸取液體中不含DNA和蛋白質(zhì)，所有樣品轉(zhuǎn)移完成后切記顛倒混勻。

（4）每一步離心時(shí)要注意固定離心管的方向，通常將離心管開(kāi)口朝向離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置，這樣產(chǎn)生的核酸會(huì)位于離心管底部靠后的一側(cè)，方便后面吸干殘液。

（5）在倒去上清倒置于吸水紙時(shí)，吸水紙要有一定的厚度，防止液體滲透到試驗(yàn)臺(tái)上，污染其他樣品，也不要在一張紙上放置過(guò)多樣品，防止不小心碰倒離心管時(shí)，樣品互相污染。用微量加樣器吸干殘液時(shí)不要碰倒離心管后部有沉淀的一面，每份樣品更換吸頭。在室溫下干燥時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)導(dǎo)致RNA不易溶于DEPC水。

（6）實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)生的吸頭應(yīng)直接打入盛有10%次氯酸鈉的廢物缸內(nèi)，并與其他廢棄物品一同交由處理醫(yī)療廢棄物的專業(yè)人員處理。工作臺(tái)及各種實(shí)驗(yàn)用品經(jīng)常用10%次氯酸鈉、75%酒精和紫外燈進(jìn)行消毒。

以上就是在工作中總結(jié)的一點(diǎn)小經(jīng)驗(yàn)，希望對(duì)大家平時(shí)的工作起到一些幫助作用，不足之處還希望大家指正，讓我們?yōu)樾竽翗I(yè)的發(fā)展保駕護(hù)航！