李尤龍 楊艷明 李登峰

（1，云南省曲靖市羅平縣大水井鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心 655800；2，云南省曲靖市羅平縣畜禽改良工作站 655800；3，云南省曲靖市羅平縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 655800）

布魯氏菌?。ê?jiǎn)稱布?。┦怯刹剪斒暇鷮偌?xì)菌感染導(dǎo)致人畜共患的常見傳染病，在全世界范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康，影響畜牧業(yè)發(fā)展。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定報(bào)告的傳染病，我國(guó)規(guī)定布病為多種動(dòng)物共患的二類動(dòng)物疫病。因此，開展家畜布病的血清學(xué)調(diào)查具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源、采樣要求和采樣比例

對(duì)去年監(jiān)測(cè)出陽(yáng)性畜的場(chǎng)（戶）100%采樣監(jiān)測(cè)，對(duì)引入飼養(yǎng)期限不足半年的牲畜實(shí)行100%采樣監(jiān)測(cè)，對(duì)養(yǎng)牛20頭以上、羊20只以上、豬50頭以上的規(guī)模場(chǎng)戶按5%比例采集血清（種公畜、母畜、育肥畜比例為1∶3∶1），對(duì)監(jiān)測(cè)有陽(yáng)性畜的養(yǎng)殖場(chǎng)（戶、企業(yè)）實(shí)行100%采樣復(fù)檢。羊共調(diào)查13個(gè)鄉(xiāng)（鎮(zhèn)、街道）105個(gè)行政村280個(gè)自然村，10個(gè)規(guī)模場(chǎng)、570戶散養(yǎng)戶，調(diào)查羊35634只，共采集羊血清2188份；豬共調(diào)查13個(gè)鄉(xiāng)（鎮(zhèn)、街道）48個(gè)行政村73個(gè)自然村，31個(gè)規(guī)模場(chǎng)，66戶散養(yǎng)戶，調(diào)查豬21318頭，共采集豬血清751份，牛共調(diào)查13個(gè)鄉(xiāng)（鎮(zhèn)、街道）16個(gè)行政村20個(gè)自然村，3個(gè)規(guī)模場(chǎng)、17戶散養(yǎng)戶，調(diào)查牛11856頭，共采集牛血清150份。

1.2 檢測(cè)試劑及儀器

布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原（批號(hào)：20180701），布病陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)血清、布病陰性標(biāo)準(zhǔn)血清，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所生產(chǎn)；布氏菌競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20180316），由青島立見診斷技術(shù)中心生產(chǎn)，于2～8℃冷藏保存?zhèn)溆?。潔凈的一次性反?yīng)板，其上已有劃好的4cm2圓圈，單道微量移液器、多道微量移液器、吸頭，純水儀、酶標(biāo)儀、二級(jí)生物安全柜，恒溫培養(yǎng)箱等。

2 檢測(cè)方法與結(jié)果判定

2.1 虎紅平板凝集試驗(yàn)和結(jié)果判定

試驗(yàn)前將待檢血清、陰性血清、陽(yáng)性血清和抗原恢復(fù)至室溫（20～25℃）。在一次性反應(yīng)板上標(biāo)記好被檢血清號(hào)，在其上滴加虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原30ul，然后在抗原旁滴加被檢血清30ul，用吸頭攪動(dòng)血清和抗原，使之充分混合，每加一個(gè)被檢血清都要換吸頭，在4min內(nèi)觀察結(jié)果，設(shè)陰性血清、陽(yáng)性血清對(duì)照。在陰、陽(yáng)性血清對(duì)照成立的條件下方可對(duì)被檢血清進(jìn)行判定。受檢血清在4min內(nèi)肉眼可見不同成度顆粒狀或絮狀凝集現(xiàn)象者判為陽(yáng)性(+)，無(wú)凝集現(xiàn)象，呈均勻粉紅色者判為陰性(-)。出現(xiàn)陽(yáng)性的再用競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附（cELISA）試驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)確診。

2.2 競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和結(jié)果判定

根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行試驗(yàn)操作和結(jié)果判定。試驗(yàn)準(zhǔn)備，試劑盒各組分在使用前均恢復(fù)至室溫（20～25℃），加液前充分搖勻，將洗滌液20倍稀釋。操作步驟，BRUC抗原包被板每孔加入稀釋好的洗滌液40ul，A1、B1孔加入10ul BRU陰性血清，C1、D1孔加入10ul BRU陽(yáng)性血清，剩余孔各加入10ul樣品血清，每孔加入50ul競(jìng)爭(zhēng)抗體，輕輕振勻，37℃孵育60min。甩干BRUC抗原包被板中的液體，每孔加入300ul洗滌液，洗滌3次，每孔加入100ul酶標(biāo)抗體，輕輕振勻，37℃孵育30min，甩干BRUC抗原包被板中的液體，每孔加入300ul洗滌液，洗滌3次，每孔加入50ul底物溶液A，再加入50ul底物溶液B，37℃孵育15min，每孔加入50ul終止液終止顯色反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)處的OD值。結(jié)果判定，BRU陰性血清的平均OD值應(yīng)大于0.5，BRU陽(yáng)性血清的OD值應(yīng)大于60%，試驗(yàn)結(jié)果有效，否則重新試驗(yàn)；樣品抑制率≥50%判為陽(yáng)性，樣品抑制率＜50%判為陰性[1]。

3 結(jié)果

通過虎紅平板凝集試驗(yàn)共集中檢測(cè)樣品3089份，其中豬血清751份、牛血清150份、羊血清2188份，2份羊血清為陽(yáng)性，其余樣品為陰性；2份羊血清陽(yáng)性樣品和180份牛羊血清陰性樣品通過競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果全為陰性。通過篩選和確診試驗(yàn)3089份血清樣品全部判定為陰性。

4 小結(jié)

（1）加強(qiáng)家畜布病的血清學(xué)學(xué)調(diào)查。每年進(jìn)行兩次集中采樣和布病血清學(xué)監(jiān)測(cè)，應(yīng)用虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT)進(jìn)行初篩，然后進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)確診。

（2）一些養(yǎng)殖戶對(duì)家畜布病防控工作的重要性認(rèn)知不足。監(jiān)測(cè)出陽(yáng)性畜的場(chǎng)（戶）進(jìn)行復(fù)檢，采集血清時(shí)，因不滿足撲殺補(bǔ)助標(biāo)準(zhǔn)阻止采樣，難做工作，需要加強(qiáng)宣傳力度。

（3）流行病學(xué)調(diào)查面廣，工作量大，需加大人力、物力、財(cái)力的投入。

（4）獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室正常運(yùn)行需要大量經(jīng)費(fèi)支持，實(shí)驗(yàn)室工作經(jīng)費(fèi)緊缺，儀器設(shè)備、試劑耗材滿足不了監(jiān)測(cè)工作的需求。監(jiān)測(cè)動(dòng)物的種類、范圍、數(shù)量等會(huì)受到限制，需加大實(shí)驗(yàn)室經(jīng)費(fèi)投入[2]。