何述輝 葉淑均 黃楊欽

（重慶市渝北區(qū)畜牧水產(chǎn)站 401120）

口蹄疫病毒是我國強制免疫病種，但口蹄疫疫苗在臨床上免疫效果并不理想。特殊情況下，嚴格隔離病畜后用中藥治療早期?？谔阋呒膊≈斡士蛇_80%左右，獲得良好的治療效果[1]。中藥或其有效成分作為免疫增強劑配合疫苗免疫能提高疫苗的免疫效果[2,3]。

1 材料與方法

1.1 主要藥品和試劑

川牛膝多糖提?。捍ㄅＯ?00g、蒸餾水、三氯甲烷、正丁醇、無水乙醇、丙酮。

川牛膝多糖硒酸酯制備：川牛膝多糖粉末、0.5%HNO3、Na2SeO3、BaCl2、碳酸鈉、pH試紙、無水硫酸鈉、抗壞血酸。

小鼠體外注射試驗佐劑：試驗小鼠50只、口蹄疫疫苗、鋁佐劑、硒酸酯多糖佐劑。

1.2 主要儀器

低速離心機(0412-1型)：上海手術(shù)器械廠。

隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GHP-9160型）：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司。

酶標儀（Bio-RAD 680型）：美國伯樂生物技術(shù)公司。

1.3 試驗動物

昆明小白鼠50只，體重18～22g。

1.4 試驗方法

川牛膝多糖的提取方法： （1）川牛膝100g研磨碾碎，加入1.2L蒸餾水煮2h，過濾并收集濾液。 （2）將濾液放入燒杯中，置于60℃水浴鍋中濃縮至100ml即得出提取液。 （3）提取液中加入提取液1/4體積的三氯甲烷、1/16體積的正丁醇，震蕩5min，在2000r/min條件下離心15min，如此重復(fù)5次。（4）加入適量的無水乙醇醇沉，靜置過夜，用丙酮、無水乙醇反復(fù)洗滌得到沉淀物，置于烘箱中烘干沉重，即可得到多糖。

川牛膝多糖硒酸酯的制備方法： （1）取川牛膝多糖1g，加入5%HNO3及100ml蒸餾水，水浴加熱至70℃。 （2）分別加入0.8g左右Na2SeO3和1.44gBaCl2在70℃的水浴鍋中靜置加熱6h。 （3）6h后取出冷卻至室溫，過濾，取濾液用無水碳酸鈉調(diào)節(jié)pH=6～7。 （4）加入1.4g無水硫酸鈉入濾液中，振蕩1min，在2000r/min離心，離心15min。 （5）離心后去上清液裝入透析袋中透析，直到用抗壞血酸檢測無紅色為止。 （6）講透析后的藥品置于真空冷凍干燥機中冷凍干燥24h得川牛膝多糖硒酸酯，取出并密封保存。 （7）經(jīng)紅外光譜檢測，合成成功。

分組及免疫程序：將小鼠隨機分為5組，每組10只。試驗分為空白組（Naive）、多糖硒酸酯組（SRCPS）、疫苗組(FMDV)、疫苗+多糖硒酸酯組(FMDV+SRCPS)、疫苗+鋁佐劑組(FMDV+alum)。所有免疫均采取腹股溝皮下注射進行免疫，空白組(Naive)小鼠注射生理鹽水（9%NaCl）200μL，多糖硒酸酯組(SRCPS)小鼠注射川牛膝多糖硒酸酯溶液200μL，疫苗組(FMDV)小鼠注射口蹄疫疫苗200μL，疫苗+多糖硒酸酯組（FMDV+SRCPS）小鼠注射口蹄疫疫苗200μL與川牛膝多糖硒酸酯溶液200μL，疫苗+鋁佐劑組(FMDV+alum)小鼠注射口蹄疫疫苗200μL與鋁佐劑200μL，14d后進行二免，方法同前。

血清采集及檢測：分別將對照組及試驗組二免后14d時進行眼眶采血1ml/只血樣靜置于4℃冰箱過夜，4000r/min，離心10min，分離出血清供檢測抗體，將血清分裝于0.2ml塑料離心管中，-20℃保存。

2 試驗結(jié)果

2.1 SRCPS對血清特異性抗體IgG水平的影響

結(jié)果顯示，各組試驗小鼠于二免15d后血清中FMDV特異性IgG的水平，各組與FMDV免疫組相比，F(xiàn)MDV+SRCPS組的IgG水平均極顯著高于FMDV組，F(xiàn)MDV+alum組的IgG水平極顯著高于FMDV組，川牛膝多糖硒酸酯能顯著提高口蹄疫特異性IgG的水平。

3 結(jié)論

本試驗結(jié)果顯示，與FMDV組相比較，F(xiàn)MDV+alum組與FMDV+SRCPS組的特異性抗體IgG水平差異顯著高于FMDV組。由此可見，川牛膝多糖硒酸酯作為口蹄疫疫苗免疫佐劑能很好地促進機體體液免疫反應(yīng)水平，為進一步將川牛膝多糖硒酸酯研究及開發(fā)成新型免疫佐劑提供理論依據(jù)。