食品中金剛烷胺類化合物檢測(cè)方法的研究

□ 熊 雯 易路遙 吉偉佳 章 紅 江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院 江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心

金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛胺是母體結(jié)構(gòu)為飽和環(huán)癸烷的金剛烷胺類化合物。金剛烷胺、金剛乙胺都是FDA批準(zhǔn)的抗甲型流感病毒的藥物，能在極低濃度下通過M2蛋白質(zhì)子通道抑制甲型流感病毒的復(fù)制[1-3]。美金剛胺是金剛乙胺的同分異構(gòu)體，作用機(jī)理相似。雖然許多國家禁止在家禽養(yǎng)殖中使用金剛烷胺和金剛乙胺[4-5]，但在中國和美國，這類化合物仍被非法用于家禽（尤其是雞）養(yǎng)殖中[6]，原因可能是：①金剛烷胺類化合物價(jià)格低廉，抗流感病毒活性好；②農(nóng)戶為減少在禽流感肆虐流行期間的經(jīng)濟(jì)損失，不顧法律法規(guī)定期給禽類喂食藥物；③飼料廠家在產(chǎn)品中添加藥物，從而吹噓該產(chǎn)品具有增強(qiáng)機(jī)體抵抗力的功效。金剛烷化合物的濫用，使得耐藥菌株出現(xiàn)，并呈增加的趨勢(shì)[7]。

在我國，獸藥已從傳統(tǒng)線下營銷模式慢慢轉(zhuǎn)向互聯(lián)網(wǎng)營銷模式，2019年9月，在“某”寶、“某”多多、“某”巴巴等APP上搜索“金剛烷胺獸用”“金剛乙胺獸用”，發(fā)現(xiàn)不少商家銷售金剛烷胺類化合物。同時(shí)，還有部分商家宣傳金剛烷胺類化合物具有預(yù)防和治療畜禽及家禽流感病毒的功效。鑒于金剛烷胺類化合物在我國的濫用情況，本文對(duì)近年來金剛烷胺類化合物的檢測(cè)方法進(jìn)行綜述，希望為監(jiān)管檢驗(yàn)研究人員提供參考和借鑒。

1 色譜分析法

1.1 高效液相色譜技術(shù)

高效液相色譜技術(shù)（HPLC)是有機(jī)化合物分析運(yùn)用中最普遍的一種檢測(cè)方法。HPLC法的檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器（包括UV、DAD)、電化學(xué)檢測(cè)器（ECD）。金剛烷胺類化合物是穩(wěn)定飽和的三環(huán)胺化合物，僅吸收小于200 nm的波長輻射，紫外響應(yīng)極小，需經(jīng)衍生化才能通過紫外檢測(cè)器測(cè)定。F.A.L.Van Der Horst等[8]采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）膠束介導(dǎo)，研究了尿中金剛烷胺柱前衍生結(jié)合反相高效液相色譜的在線測(cè)定方法。在60 ℃和pH為11條件下，金剛烷胺與1-氟-2，4-二硝基苯進(jìn)行衍生化，4 min內(nèi)完全轉(zhuǎn)化為含有色基團(tuán)的衍生物，從而產(chǎn)生紫外檢測(cè)信號(hào)。該法檢測(cè)金剛烷胺的低限是75 ng/mL。劉益慶等[9]采用蒸發(fā)光散色高效液相色譜法測(cè)定小兒氨酚烷胺顆粒中鹽酸金剛烷胺的含量，蒸發(fā)光散色檢測(cè)器是通用質(zhì)量型檢測(cè)器，可以檢測(cè)任何有機(jī)物質(zhì)，用于基質(zhì)干擾小化合物的檢測(cè)，對(duì)于食品等復(fù)雜基質(zhì)并不適用。

1.2 氣相色譜法

張翠芬等[10]采用甲醇∶三氯乙酸（1∶1）提取飼料中金剛烷胺，經(jīng)MCX陽離子固相萃取柱凈化，建立檢測(cè)金剛烷胺含量的FID氣相色譜外標(biāo)定量法。飼料中金剛烷胺的添加量一般為100～200 mg/kg，該方法檢出限為1.0 mg/kg，其回收率為76.9%～98.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，以上參數(shù)均符合實(shí)驗(yàn)要求。

1.3 高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀法

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)金剛烷胺類化合物的定性和定量檢測(cè)具有較高的準(zhǔn)確度。因此，HPLC-MS法成為這類化合物研究分析最主要的方法[11-12]，也是我國法定標(biāo)準(zhǔn)使用的唯一方法。

Dawei Chen等[6]提出一種提取雞肌肉中金剛烷胺、金剛乙胺和美金剛胺的分散微固相萃取法（DMSPE）。試驗(yàn)以1%酸性乙腈為提取溶劑，磁性陽離子交換聚合物為吸附劑，采用DMSPE凈化技術(shù)得到供試品溶液， 經(jīng) HSST3（100 mm×2.1 mm i.d.，1.8 μm）色譜柱分離，UHPLCHRMS測(cè)定金剛烷類藥物的含量。結(jié)果表明，DMSPE方法簡便、有效，適用于雞肌肉中金剛烷類藥物的提取，提取時(shí)間相對(duì)較短。Yinliang Wu等[13]以d15-金剛烷胺、d4-金剛乙胺-、d6-美金剛胺為內(nèi)標(biāo)，采用多壁碳納米管（MWCNTs）作為反相分散固相萃?。╮-dSPE）材料，結(jié)合超高液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，建立同時(shí)測(cè)定雞肌肉中金剛烷胺、金剛乙胺和美金剛胺含量的方法。在最佳優(yōu)化條件下，雞肌肉中3種藥物的回收率為96.8%～104.6%，變異系數(shù)（CV）為3.8%～6.4%。

1.4 氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

N Narasimhachari等[14]采 用 兩步法從生物樣品中提取金剛烷胺，經(jīng)二硫化碳處理，轉(zhuǎn)化為其異硫氰酸酯（NCS）衍生物，以苯丙胺為內(nèi)標(biāo)物，再以NCS-金剛烷胺進(jìn)行定量。

2 酶免疫法

2.1 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）

酶聯(lián)免疫吸附法是一種由吸附底物、免疫識(shí)別和酶標(biāo)組成的免疫檢測(cè)方法。其優(yōu)點(diǎn)是前處理快捷方便、儀器便宜易操作；缺點(diǎn)是靈敏度和準(zhǔn)確度較低。該法在食品農(nóng)藥殘留、真菌毒素、獸藥殘留中廣泛運(yùn)用，近年來在食品安全性快檢技術(shù)中成為發(fā)展熱點(diǎn)。

Dapeng Peng等[15]致力于研發(fā)一種對(duì)金剛烷胺類化合物具有高親和力的單克隆抗體（mAb)，該抗體對(duì)AMA（半抑制濃度為100%）和RIM（半抑制濃度為70.6%）具有交叉反應(yīng)活性，并通過ELISA法檢測(cè)可食用雞組織中金剛烷胺和金剛乙胺，金剛烷胺和金剛乙胺的檢出限均達(dá)5.1、5.5 μg/kg。實(shí)驗(yàn)喂養(yǎng)20批陽性雞樣品，同時(shí)采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和高效液相色譜-質(zhì)譜法（HPLC-MS）檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ic-ELISA與HPLC-MS的結(jié)果具有良好相關(guān)性。

譚庶等[16]合成出可特異性識(shí)別金剛烷胺的單克隆抗體，采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析法測(cè)定雞肉基質(zhì)中金剛烷胺的含量。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，金剛烷胺與結(jié)構(gòu)和功能類似物的交叉反應(yīng)率均小于0.01%，但與金剛乙胺交叉反應(yīng)率為29.89%，其在0.07～6.15 μg/L線性良好，檢出限為0.21 μg/L，雞肉樣品中添加回收率為101.69%～108.71%，變異系數(shù)低于10.57%。

2.2 化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLEIA）

化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLEIA）是將化學(xué)發(fā)光法（CL）與酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）技術(shù)相結(jié)合，具有化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的高靈敏度與免疫反應(yīng)的高特異性兩種優(yōu)點(diǎn)[17]。近年來，CLEIA被廣泛應(yīng)用于多種食品痕量分析領(lǐng)域[18-19]。

崔廷婷等[20]以AMD單克隆抗體與磁珠偶聯(lián)形成AMD磁標(biāo)抗體，魯米諾+對(duì)羥基聯(lián)苯+過氧化氫作為發(fā)光物質(zhì)，建立動(dòng)物組織、獸藥、飼料中金剛烷胺殘留化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法。該方法的半抑制濃度為0.481 μg/L，在3種基質(zhì)樣本中的檢測(cè)限為0.1 μg/kg，添加回收率在80.2%～94.5%。金剛烷胺的印跡因子達(dá)到2.33，金剛乙胺、美金剛胺、曲金剛胺3個(gè)結(jié)構(gòu)類似物的選擇性因子達(dá)到6.20、5.29和3.95。

3 分子印跡電化學(xué)傳感器技術(shù)

分子印跡技術(shù)是基于免疫原理發(fā)展形成的一種新興分子識(shí)別技術(shù)。傳感器的分子印跡聚合物與基質(zhì)樣品中的目標(biāo)化合物會(huì)發(fā)生識(shí)別作用，從而產(chǎn)生一些物理學(xué)信號(hào)（電極、電阻等）變化，通過效應(yīng)器轉(zhuǎn)換成可測(cè)信號(hào)，以檢測(cè)目標(biāo)化合物；合成的分子印跡聚合物代替生物受體作為傳感器的識(shí)別元件逐漸成為許多研究的重點(diǎn)[21]。

Yaguang Yun等[22]以金剛烷胺作為模板分子，鄰氨基苯硫酚為功能單體，通過電沉積技術(shù)在金電極表面聚合形成聚鄰氨基苯硫酚聚合物膜，研制了一種用于動(dòng)物源性食品中金剛烷胺殘留檢測(cè)的新型分子印跡聚合物電化學(xué)傳感器。為使分子印跡傳感器的性能達(dá)到最佳，優(yōu)化了模板/單體比、CV掃描循環(huán)數(shù)、浸漬時(shí)間等系列參數(shù)。實(shí)驗(yàn)表明，金剛烷胺的印跡因子達(dá)到2.33，金剛乙胺、美金剛胺、曲金剛胺3個(gè)結(jié)構(gòu)類似物的選擇性因子分別達(dá)到6.20、5.29和3.95。該方法與典型的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用方法所得結(jié)果一致，具有較高的相關(guān)系數(shù)（R2＞0.99）。

4 熒光探針技術(shù)

熒光探針技術(shù)是針對(duì)不具備熒光或者弱熒光特性的化合物，用間接法來進(jìn)行熒光檢測(cè)的一種技術(shù)。金剛烷胺、金剛乙胺是三環(huán)癸烷化合物，沒有天然熒光，常規(guī)熒光法無法直接測(cè)定，大量文獻(xiàn)報(bào)道熒光光譜利用熒光探針技術(shù)測(cè)定其含量[23-25]。

4.1 超分子包合物探針

具有一定尺寸空腔的超分子環(huán)糊精、杯芳烴、葫蘆脲等主體分子和客體分子（熒光指示劑）以分子間弱相互作用（靜電相互作用、氫鍵、范德華力等）在溶劑體系形成穩(wěn)定的化合物，待測(cè)化合物通過與熒光指示劑競(jìng)爭(zhēng)空腔，引起熒光強(qiáng)度的改變來進(jìn)行含量測(cè)定[26]。Guangquan Wang等[,25]以黃連堿-葫蘆[7]脲為熒光探針體系測(cè)定藥品制劑和尿液中金剛烷胺和金剛乙胺含量，線性范圍在0.004 0～1.0 μg/mL，通過熒光光譜法、核磁共振氫譜和分子模型計(jì)算，研究了兩種藥物與黃連堿競(jìng)爭(zhēng)葫蘆[7]脲空腔的超分子相互作用機(jī)制。朱林照等[,26]合成了一種熒光指示劑ABAM，它和葫蘆[7]脲構(gòu)建成新的熒光探針體系，對(duì)金剛烷胺有較好的特異性、同時(shí)抗干擾性強(qiáng)，其結(jié)合常數(shù)為8.7×10-8M-1，金剛烷胺化合物在0.000 188～0.375 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低檢測(cè)濃度為6.5×10μ5μg/mL。該熒光探針系統(tǒng)對(duì)藥物及動(dòng)物肉類等樣品中金剛烷胺濃度的檢測(cè)具有重要意義。本研究利用內(nèi)過濾效應(yīng)（IFE）將CDs引入酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）系統(tǒng)，研制了一種新型熒光酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法。

4.2 碳點(diǎn)探針

碳點(diǎn)是指三維空間尺寸均在1～10 nm的零維度碳納米晶體[27]。近兩年，碳點(diǎn)因其光致發(fā)光特性，較高的熒光穩(wěn)定性，良好的生物相容性，在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域展現(xiàn)廣泛的應(yīng)用前景[28]。

Baolei Dong等[29]以碳點(diǎn)（CDs）和MnO2納米片（NSs）的納米組裝物為熒光探針，建立一種熒光酶聯(lián)免疫吸附法用于檢測(cè)食品中金剛烷胺，碳點(diǎn)（CDs）作為熒光底物，MnO2納米片為熒光淬滅劑及識(shí)別單元，形成p-CDs@MnO2NSs的探針體系。2-磷酸抗壞血酸經(jīng)抗體標(biāo)記的堿性磷酸酶（ALP）催化，水解生成抗壞血酸，其能分解納米組裝物，使CDs游離從而恢復(fù)熒光。熒光強(qiáng)度的變化與溶液中金剛烷胺的濃度有關(guān)，該法線性范圍為0.048～1.1 ng/mL，檢測(cè)限（LOD）為0.035 ng/mL。

5 結(jié)語

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法是測(cè)定食品中金剛烷胺類化合物最經(jīng)典的分析方法，具有高選擇性、高靈敏度、高準(zhǔn)確度和無需衍生等優(yōu)點(diǎn)，且常被用于評(píng)估其他檢驗(yàn)方法的優(yōu)劣。近年來，各種仿生抗體、超分子和納米晶體成功制備，并運(yùn)用于金剛烷胺類化合物含量測(cè)定，這類方法屬于分子識(shí)別技術(shù)，但文獻(xiàn)鮮有報(bào)道相似結(jié)構(gòu)化合物是否存在干擾，這一系列方法操作較為簡便，為金剛烷胺化合物的檢測(cè)提供了良好的思路，將來也必是檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的新方向。