王杰瓊,孫文君,田 溪,李薈好,孫 亞,王 帥，郜彥鑫

(山東中醫(yī)藥大學(xué)1. 藥學(xué)院、2.中醫(yī)學(xué)院、3.中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，山東 濟(jì)南 250355)

經(jīng)前期綜合征(premenstrual syndrome，PMS)系指育齡期女性在月經(jīng)黃體期，周期性出現(xiàn)的軀體、精神和行為三方面癥狀的癥候群，屬情志病癥范疇。PMS 肝氣逆證是其主要亞型之一，以肝疏泄太過(guò)、經(jīng)前煩躁易怒為主要特征[1],并且“經(jīng)前出現(xiàn)，經(jīng)后消失”是該病癥典型特點(diǎn)。白芍是促進(jìn)肝主疏泄，維持正常情志活動(dòng)的要藥。課題組前期研發(fā)復(fù)方藥物白香丹膠囊能有效改善PMS肝氣逆證主證煩躁易怒，其中白芍提取物為其君藥[2]，但是該藥在PMS肝氣逆證治療中的作用機(jī)制尚不清晰。

蘇巧榮等[3]指出，雌激素受體(estrogen receptor，ER)主要是通過(guò)5-羥色胺(serotonin, 5-HT)能系統(tǒng)發(fā)揮對(duì)情緒的調(diào)節(jié)作用，中樞5-HT活性降低時(shí)，機(jī)體對(duì)應(yīng)激刺激的敏感性增加，從而引起抑郁或焦慮等負(fù)性情緒[4]。Jantarima等[5]發(fā)現(xiàn)，雌二醇(estradiol,E2)可通過(guò)上調(diào)5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(serotonin transporter,SERT) mRNA表達(dá)，提高5-HT能系統(tǒng)成分含量及轉(zhuǎn)化率，達(dá)到治療去卵巢大鼠焦慮樣情緒的目的。另有研究報(bào)道，海馬在情緒調(diào)節(jié)及相關(guān)情志疾病發(fā)病機(jī)制中占有重要地位。因此，本研究選擇海馬作為研究對(duì)象，探討白芍提取物對(duì)PMS肝氣逆證模型大鼠ERβ及其介導(dǎo)的5-HT能系統(tǒng)中SERT的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠，♀，150只，體質(zhì)量150～180 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供, 許可證號(hào)：SCXK(京)2007-0001。晝夜顛倒(早9:00關(guān)燈，晚9:00開(kāi)燈)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2試劑白芍提取物由青島海川創(chuàng)新生物天然藥物研究中心提供，芍藥苷含量35%；鹽酸氟西汀膠囊(禮來(lái)蘇州制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20130010)；ERβ激動(dòng)劑diarylpropionitrile(DPN)(ab120166)、ERβ兔多克隆一抗(ab3577)、SERT兔多克隆一抗(ab44520)，均購(gòu)于A(yíng)bcam公司；FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(A0562，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；TRIzol總RNA提取試劑盒(SK1322，上海生工公司)；Oligod(T)18 primers (D511，TaKaRa公司)；M-MLV試劑盒(D2639A，TaKaRa公司)。

1.3PMS電刺激大鼠模型制備

1.3.1曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)[6]本實(shí)驗(yàn)采用陰道涂片法篩選動(dòng)情周期規(guī)律大鼠納入實(shí)驗(yàn)。造模前后，采用50 cm×50 cm×40 cm曠場(chǎng)箱和Xmaze動(dòng)物行為分析系統(tǒng)，記錄大鼠3 min內(nèi)的活動(dòng)總路程。

1.3.2動(dòng)物分組造模及給藥 將60只合格大鼠，據(jù)曠場(chǎng)總路程和大鼠體質(zhì)量隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組、PMS肝氣逆模型組、氟西汀對(duì)照組、ERβ激動(dòng)劑DPN給藥組、白芍提取物給藥組。造模方法如下：除正常組外，其他各組大鼠均置于ST-A數(shù)字脈沖生物刺激儀。電壓2 700～3 300 V，脈寬0.3 s，脈沖間隔為白天5 min，夜晚10 min，持續(xù)5 d，造模過(guò)程中除正常組、模型組同時(shí)給予生理鹽水外，其余各組給予相應(yīng)藥物。

各組給藥情況如下：正常組及模型組給予生理鹽水，白芍提取物組灌胃劑量為40 mg·kg-1·d-1[7]；氟西汀組給藥劑量2.67 mg·kg-1·d-1；激動(dòng)劑組大鼠皮下注射ERβ激動(dòng)劑DPN(DPN 40 mg溶于1 mL DMSO渦旋震蕩溶解后，再加入19 mL 25% DMSO配制成2 g·L-1DPN溶液)，給藥劑量2 mg·kg-1·d-1，各組給藥時(shí)間5 d，每天1次。于末次給藥后30 min,采用陰道涂片確定動(dòng)情周期，其中每組6只大鼠用于海馬ERβ和SERT mRNA表達(dá)測(cè)定，另外6只用于海馬組織ERβ和SERT的分布和蛋白表達(dá)測(cè)定。

1.4海馬ERβ和SERTmRNA表達(dá)測(cè)定各組大鼠斷頭取腦，繼而分離海馬組織，立即放入液氮罐中，儲(chǔ)存于-70 ℃。采用TRIzol 法提取總RNA。取1 μg總RNA，按1 μg/20 μL反應(yīng)體系逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，擴(kuò)增條件: 94 ℃ 150 s,預(yù)變性；94 ℃ 30 s，變性；(ERβ：61.6 ℃ 40 s；SERT：61 ℃ 40 s；β-actin:59 ℃ 40 s )復(fù)性；72 ℃ 1 min延伸；72 ℃ 7 min，再延伸。之后，取8 μL cDNA產(chǎn)物，以1.2%瓊脂糖凝膠電泳(含1%綠如藍(lán)DNAgreen)電泳，電壓120 V，時(shí)間30 min。以目的基因/β-actin為mRNA相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)行半定量分析。參照 Gene Bank大鼠基因序列合成ERβ、SERT和β-actin引物，引物序列見(jiàn)Tab 1[8]。

Tab 1 Primer sequence and product size of ERβ and SERT

1.5海馬中ERβ和SERT分布狀態(tài)及蛋白表達(dá)各組大鼠用1%戊巴比妥鈉(4 mL·kg-1)麻醉,心臟灌流后取全腦，置于4%多聚甲醛中4 ℃封閉。1周后，進(jìn)行石蠟包埋，切片(厚約5 μm，切片角度5°)。脫蠟、修復(fù)后，滴加正常山羊血清封閉工作液50 μL，室溫反應(yīng)30 min。將ERβ和SERT一抗稀釋液50 μL于目標(biāo)切片上進(jìn)行孵育，避光滴加FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗50 μL，37 ℃孵育30 min，0.01 mol·L-1PBS漂洗3次，每次5 min，隨后避光滴加抗熒光衰減封片劑，封片4 ℃保存。利用激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)ZEISS公司,LSM510型)觀(guān)察ERβ和SERT在海馬CA1、CA3區(qū)的分布及表達(dá)。每張切片選取3個(gè)視野。使用Image-Pro Plus6.0分析數(shù)據(jù)，并計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度(relative mean fluorescence intensity, RMFI)，RMFI=積分光密度(IOD)/圖片總面積(area)。

1.6數(shù)據(jù)處理利用統(tǒng)計(jì)軟件GraphPad Prism 6進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間比較采用One-way ANOVA檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1曠場(chǎng)行為學(xué)結(jié)果如Fig 1所示，與正常組相比，模型組大鼠自主活動(dòng)頻繁，總路程明顯上調(diào)(P<0.01)；與模型組相比，白芍提取物干預(yù)后，大鼠自主活動(dòng)趨于正常，總路程明顯下調(diào)(P<0.05)，與氟西汀和ERβ激動(dòng)劑組表達(dá)一致。

Fig 1 Total distance of rats in each group

**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsmodel

2.2大鼠海馬SERT、ERβmRNA的表達(dá)如Fig 2所示，與正常組相比，大鼠接受期，各組大鼠中樞海馬ERβ、SERT mRNA表達(dá)均無(wú)明顯變化(P>0.05)。在非接受期，PMS肝氣逆證模型大鼠中樞海馬ERβ mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，SERT mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)；白芍提取物干預(yù)后，明顯上調(diào)ERβ mRNA表達(dá)，下調(diào)SERT mRNA表達(dá)(P<0.05)，并且與氟西汀和ERβ激動(dòng)劑組表達(dá)一致。

2.3大鼠海馬CA1、CA3區(qū)SERT、ERβ的蛋白表達(dá)分布如Fig 3所示，大鼠接受期，與正常組和模型組比較，各組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)錐體細(xì)胞多為圓狀或點(diǎn)狀，排列緊密，差異均有顯著性；ERβ、SERT的RMFI差異無(wú)顯著性(P>0.05)。大鼠非接受期：與正常組比較，模型組大鼠海馬CA1、CA3腦區(qū)錐體細(xì)胞排列不規(guī)則，ERβ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和RMFI均明顯下降(P<0.01，P<0.05)；SERT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和RMFI均明顯升高(P<0.01，P<0.05)；與模型組比較，白芍提取物干預(yù)后細(xì)胞形態(tài)趨于正常，ERβ的RMFI明顯升高(P<0.01，P<0.05)，SERT的RMFI明顯下降(P<0.01，P<0.05)，并且與氟西汀和ERβ激動(dòng)劑組表達(dá)一致，差異無(wú)顯著性。

3 討論

PMS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前5-HT作為該病癥腦內(nèi)重要的單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)成為研究熱點(diǎn)之一，SERT作用于5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，對(duì)腦內(nèi)5-HT水平起到調(diào)控作用。動(dòng)物遺傳學(xué)的研究結(jié)果證實(shí)，腦內(nèi)單胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能與行為學(xué)表現(xiàn)及情緒狀態(tài)密切相關(guān)。完全喪失SERT功能的基因敲除小鼠表現(xiàn)出5-HT綜合征樣行為、焦慮抑郁樣行為、焦慮抑郁樣癥狀及社交障礙[9]。

諸多研究表明，ER對(duì)情緒沒(méi)有直接調(diào)節(jié)作用，而是通過(guò)5-HT能系統(tǒng)與GABA能系統(tǒng)間接實(shí)現(xiàn)的。5-HT能系統(tǒng)中SERT主要功能是將5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)到腦及外周組織的相關(guān)受體而發(fā)揮作用，因此，SERT功能異常會(huì)導(dǎo)致5-HT及其受體相應(yīng)功能異常，進(jìn)而出現(xiàn)焦慮、恐懼、抑郁等消極情緒障礙。有研究顯示，ERβ基因敲除小鼠易煩躁易怒、焦慮不安[10]。Walf等[11]研究發(fā)現(xiàn)，雌激素可作用于海馬和杏仁核的細(xì)胞內(nèi)ER，發(fā)揮抗焦慮的作用。也有文獻(xiàn)報(bào)道[12]，雌激素可調(diào)節(jié)海馬CA1區(qū)突觸發(fā)生。另有研究發(fā)現(xiàn)[13]，雌激素可引起去卵巢恒河猴SERT mRNA在中縫背核的表達(dá)明顯下降，SERT mRNA陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量也明顯減少。因此，說(shuō)明雌激素及其受體能夠介導(dǎo)5-HT能系統(tǒng)功能。

本研究采用改進(jìn)的情志刺激為主的多因素造模法，主要通過(guò)電刺激復(fù)制PMS肝氣逆證大鼠模型，將非接受期大鼠置入可調(diào)式電刺激籠內(nèi)，在減少電擊造成的軀體傷害的同時(shí)加強(qiáng)心理性應(yīng)激[14]，利于模型的成功復(fù)制。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)可用來(lái)評(píng)判動(dòng)物焦慮和抑郁狀態(tài)[15]。本研究結(jié)果顯示，大鼠在非接受期，模型組活動(dòng)總路程明顯升高，說(shuō)明PMS肝氣逆證模型大鼠表現(xiàn)出焦慮樣行為。給予白芍提取物后，活動(dòng)總路程明顯較少，說(shuō)明白芍提取物可明顯改善PMS肝氣逆證引起的負(fù)性情緒。

基因檢測(cè)結(jié)果顯示，大鼠動(dòng)情接受期，各類(lèi)指標(biāo)并無(wú)明顯變化。在非接受期，PMS肝氣逆證模型大鼠海馬ERβ mRNA表達(dá)明顯降低，SERT mRNA明顯上調(diào)；海馬CA1、CA3區(qū)錐體細(xì)胞排列雜亂，ERβ 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目減少，RMFI明顯下降，SERT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目增多，RMFI明顯升高，給予白芍提取物后的細(xì)胞形態(tài)趨于正常。以上研究結(jié)果與本研究所得模型大鼠海馬區(qū)ERβ mRNA和蛋白表達(dá)均明顯下降，SERT mRNA和蛋白表達(dá)升高均一致。提示白芍提取物可能具有雌激素樣作用，或者能夠通過(guò)改善中樞海馬ERβ的功能，繼而糾正5-HT能系統(tǒng)中SERT的功能，最終起到調(diào)整PMS肝氣逆證煩躁易怒等主要癥狀的作用。

Fig 2 Expression of ER and SERT mRNA in hippocampus of rats at both estrous receptive(A) and non-receptive

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel;1：Control;2:Model;3:Paeonifiorin extract;4:Fluoxetine;5:ERβ agonist

綜上所述，采用情志刺激為主多因素造模法可以成功制備PMS肝氣逆證大鼠模型，模擬PMS主要特征“經(jīng)前出現(xiàn)，經(jīng)后消失”。通過(guò)該模型的研究，初步證明PMS肝氣逆證的發(fā)病機(jī)制可能與大鼠海馬ERβ、SERT的蛋白表達(dá)和mRNA的改變有關(guān)。白芍提取物有可能發(fā)揮雌激素樣作用，通過(guò)改善海馬區(qū)ERβ 和SERT的表達(dá)，起到調(diào)節(jié)PMS肝氣逆證負(fù)性情緒的作用。但是白芍提取物雌激素樣作用及其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

(本實(shí)驗(yàn)是在山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所完成，感謝該研究所及情志病證創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)所有同仁的支持和幫助)