馮文杏，周小舟，張衛(wèi)，韓志毅，孫新鋒，馬文峰

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳 518033)

原發(fā)性肝癌是危及人們生命健康的一大問(wèn)題，常見的是肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)，發(fā)病率占90%[1]，其次是肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)。HCC是世界第六大常見惡性腫瘤和第四位癌癥相關(guān)死亡原因[2]。我國(guó)每年因HCC死亡的人數(shù)約38.3萬(wàn)人，占全球HCC死亡人數(shù)的51%[3]。病毒性肝炎、脂肪性肝炎、過(guò)度飲酒、黃曲霉素等均與肝癌的發(fā)生相關(guān)，所以腫瘤發(fā)展過(guò)程中存在各種病原因素、腫瘤異質(zhì)性等，宏觀和微觀存在一定差異。HCC起病隱匿，很多患者診斷時(shí)已是晚期，僅1/3的新確診患者適合于治愈性治療，故預(yù)后較差。

隨著技術(shù)的進(jìn)步和對(duì)HCC生物學(xué)的理解增加，不斷有新的標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)。提高對(duì)血清和組織標(biāo)志物的認(rèn)識(shí)可以對(duì)這一致死性疾病的早期診斷和早期的診療策略產(chǎn)生積極的影響。由于其非侵入性、目的性及能反復(fù)評(píng)估的潛力，血清標(biāo)志物可以成為更有潛力監(jiān)測(cè)和早期診斷HCC的工具，到目前為止，許多生物標(biāo)志物已被推薦用于HCC診斷。中醫(yī)藥對(duì)HCC的治療具有較好的療效，但目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和中醫(yī)藥都尚未發(fā)現(xiàn)有效的藥物作用靶標(biāo)。運(yùn)用宏觀辨證思維雖可洞察病機(jī)，但由于不同病原因素對(duì)HCC的致病影響不同，可導(dǎo)致臨床癥狀表現(xiàn)不同、治療效果不盡相同，顯示異質(zhì)性，即存在微觀差異。

1 HCC診斷、預(yù)后和預(yù)測(cè)的組織標(biāo)志物

內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志CD34和抗平滑肌抗體(SMA)陽(yáng)性，提示廣泛的新血管化過(guò)程和肝竇毛細(xì)血管化。三種特異性免疫標(biāo)志物過(guò)度表達(dá)(Glypican-3，GPC3；HSP70;Glutamine synthetase-GS)已被認(rèn)為是小的和早期HCC選擇性標(biāo)志物[4]。P21激活酶5(PAK5)可能成為HCC有利的診斷/預(yù)后標(biāo)志[5]。內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志如CD31、CD34或von Willebrand因子有顯著的預(yù)后潛能；血管生長(zhǎng)因子(VEGF)和其他調(diào)節(jié)因子高表達(dá)與總體生存率(OS)、自由生存復(fù)發(fā)和切除后早期復(fù)發(fā)相關(guān)；上皮細(xì)胞間質(zhì)化(EMT)，可獲得不受限制的運(yùn)動(dòng)性和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的潛力[6];60%HCC p53基因失去活性[7];選擇性抑制VEGF途經(jīng)已集中于HCC分子治療領(lǐng)域的靶向研究，尤其是索拉菲尼，一種持續(xù)的Raf/Map酶抑制劑。

2 HCC血清標(biāo)志物及基因組學(xué)時(shí)代

因低敏感性和低的特異性，對(duì)甲胎蛋白(AFP)作為監(jiān)測(cè)性的檢測(cè)指標(biāo)已漸漸引起爭(zhēng)議。日本的研究結(jié)果提示,在AFP水平低和US無(wú)可疑發(fā)現(xiàn)時(shí)，甲胎蛋白異質(zhì)體-3(AFP-L3)升高是HCC形成的早期預(yù)測(cè)因子；AFP-L3%陽(yáng)性的患者能更早形成血管侵犯和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，AFP-L3%被考慮作為HCC侵襲性標(biāo)志[8]；異常凝血酶原(Des-r-Carboxy Prothrombin，DCP)參與腫瘤血管形成，增加血管生成因子如VEGF-R、VEGF和MMP-2基因表達(dá)，Meta分析提示DCP在HCC中有中等的準(zhǔn)確性[9]；研究顯示，在VEGF中單個(gè)核苷酸多態(tài)性(SNPs)是HCC切除患者生存預(yù)測(cè)因子[10]；p53基因突變?cè)贖CC早期無(wú)變化，主要在HCC晚期血管形成時(shí)才有變化，這就限制了其在診斷中的作用。TGF-b1 mRNA血清水平在HCC患者中升高，并且與肝癌形成和腫瘤血管形成相關(guān)；miRNA在HCC細(xì)胞中不同的表達(dá)提示其在預(yù)測(cè)HCC預(yù)后的潛在價(jià)值。本課題組建立了X基因陽(yáng)性與陰性的HepG2細(xì)胞，用 ELISAs法對(duì)深圳和美國(guó)韓國(guó)移民HBV未感染者、HBV和HCV相關(guān)的慢性肝病及HCC患者進(jìn)行癌相關(guān)抗體研究。發(fā)現(xiàn),抗URG11和URG19多見于HBV相關(guān)HCC患者中，而抗URG7，DRG2多見于HBV相關(guān)沒(méi)有發(fā)生HCC患者中；另外，在發(fā)生HCC之前有4個(gè)或更多抗體被檢測(cè)出[11-13]。

應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)尋找肝癌新的標(biāo)記物的研究層出不窮。DNA異常甲基化在肝癌細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，Zhang等[14]利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)在肝癌腫瘤細(xì)胞中平均甲基化水平要比癌旁細(xì)胞更低；Wu等[15]認(rèn)為白細(xì)胞中整體DNA甲基化水平可以作為肝癌風(fēng)險(xiǎn)診斷標(biāo)記物；另外在肝癌患者游離的DNA中也發(fā)現(xiàn)了高度甲基化CpG島[16]。在轉(zhuǎn)錄物組水平上通過(guò)深度測(cè)序發(fā)現(xiàn)一種新的帶有編碼區(qū)域的基因DUNQU1，在HCV呈陽(yáng)性中特異性表達(dá)，而且FGFR2的可變剪接與病毒感染、腫瘤大小和復(fù)發(fā)等相關(guān)[17]；研究發(fā)現(xiàn)HBV相關(guān)HCC患者甲基化前五的DNA是DAB2IP、BMP4、ZFP41、SPDY1和CDKN2A,去甲基化的前五個(gè)DNA是CCL20、ATK3、SCGB1D1、WFDC6和PAX4[18]。

MicroRNA(miRNA)可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)mRNA異常增殖表達(dá)與肝癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，最有可能成為HCC早期診斷的標(biāo)志物[19-20]；Hou等[21]通過(guò)對(duì)肝癌miRNA組的分析發(fā)現(xiàn),miR-199a/b-3p在肝癌中顯著下調(diào)；Law等[22]對(duì)肝癌miRNA轉(zhuǎn)錄物組進(jìn)行研究揭示了miR-1323在肝癌中的高表達(dá)；在關(guān)于HBV相關(guān)HCC患者的隊(duì)列研究中發(fā)現(xiàn)，女性的miR-26a和miR-26b表達(dá)高于男性，miR-26a和miR-26b低表達(dá)與短期生存相關(guān)。另外一些研究認(rèn)為長(zhǎng)鏈非編碼RNAs(long noncoding RNAs，lncRNAs)對(duì)HCC診斷和預(yù)后是一種新的標(biāo)志物；具有調(diào)節(jié)蛋白、RNA活性、轉(zhuǎn)錄、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞代謝的作用，眾多研究證明了lncRNAs在HCC的形成、發(fā)展和預(yù)后作用[23-25]。

3 肝癌微觀辨證學(xué)研究及HCC氣血辨證創(chuàng)新和發(fā)展

微觀辨證學(xué)崛起于20世紀(jì)80年代，是一門介乎基礎(chǔ)與臨床學(xué)科之間主體學(xué)科[26]，秉持“司外揣內(nèi)”的中醫(yī)思想，認(rèn)為疾病的證候是在一定病因刺激下發(fā)生發(fā)展而成，其中的病因刺激一方面可以理解為傳統(tǒng)的風(fēng)、寒、暑、濕、燥、火等邪氣或病理產(chǎn)物，亦可以更深入細(xì)化到神經(jīng)、免疫、代謝等環(huán)節(jié)，微觀辨證即從這個(gè)角度觸發(fā)，意在探尋宏觀證候下的微觀規(guī)律，打破了傳統(tǒng)辨證的思維局限。肝癌的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，是多環(huán)節(jié)、多因素的，運(yùn)用多學(xué)科交叉，能為肝癌辨證分型提供生物學(xué)依據(jù)[27]。費(fèi)鳳英等[28]發(fā)現(xiàn)TM三項(xiàng)聯(lián)檢聯(lián)，即AFP、AFP-L3和 α-L-巖藻糖苷酶(AFU)，可提高AFP陰性肝癌診斷率，或?qū)Ω伟┍孀C診斷有價(jià)值；張紅等[29]發(fā)現(xiàn)肝癌不同證型中AFP、CEA存在差異；黃爭(zhēng)榮等[30]應(yīng)用SEIDI-T0F-MS篩選出2個(gè)可鑒別肝郁氣滯型與肝膽濕熱型肝癌患者的差異蛋白質(zhì)；李夢(mèng)萍等[31]研究發(fā)現(xiàn)，不同證型肝癌患者肝組織某些miRNA水平有差異，其中miR-122-3P明顯高于正常組，氣虛血瘀組最明顯。這些研究對(duì)肝癌的辨證診斷從傳統(tǒng)的象、證等深入到血清標(biāo)志物、蛋白質(zhì)水平甚至基因表達(dá)層次，是中醫(yī)宏觀與微觀聯(lián)系的探索，亦是嘗試對(duì)難以把握的宏觀辨證一個(gè)客觀量化。

氣血辨證是中醫(yī)辨證的方法之一，在臟腑經(jīng)絡(luò)學(xué)說(shuō)的基礎(chǔ)上，從氣血的角度分析疾病證候?！吧蒲詺庹?，必彰于物”“氣”與“物”是相互維系的，微小物質(zhì)的變化或可反映氣血的變化，揭示規(guī)律，在這一想法啟示下，導(dǎo)師周小舟教授首創(chuàng)了HCC氣血微觀辨證學(xué)。自90年代以來(lái)，導(dǎo)師運(yùn)用中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合研究對(duì)HCC氣血微觀辨證診斷和治療進(jìn)行了一系列探索，初步發(fā)現(xiàn)不同證型之間存在血清腫瘤標(biāo)志物等微觀差異。研究比較69例氣虛血瘀證和74例氣滯血瘀證HCC患者病原因素、臨床表現(xiàn)和病理類型發(fā)現(xiàn)：年齡小于50歲患者占比、疼痛癥狀、病理分型為彌漫型和巨塊型肝癌及AFP 20～200 ng/mL陽(yáng)性率，后者明顯高于前者；吸煙、HBsAg陽(yáng)性占比，伴有肝硬化、病理類型為單個(gè)小結(jié)節(jié)型、TNM分期IV 期及AFP>400 ng/mL陽(yáng)性率，前者明顯高于后者。研究結(jié)果提示：年齡、吸煙、HBsAg陽(yáng)性、肝硬化、病理類型等因素可能是形成不同證型的微觀基礎(chǔ)[32]；采用抗癌方聯(lián)合TACE治療64例氣虛血瘀型原發(fā)性肝癌患者臨床顯示，患者的血清AFP水平改善、1年生存率、中醫(yī)臨床證候改善等均高于對(duì)照組[33]。此外，導(dǎo)師也探索了金屬離子、免疫細(xì)胞等與肝癌證型之間的關(guān)系[34-36]。中醫(yī)經(jīng)典的辨證論治以宏觀的象為把握點(diǎn)，這一系列對(duì)微觀的研究將推進(jìn)對(duì)不同疾病證候發(fā)生發(fā)展的規(guī)律的了解，是對(duì)宏觀“氣血辨證”的補(bǔ)充。

4 結(jié)語(yǔ)

腫瘤異質(zhì)性在HCC中是廣泛存在的，有復(fù)雜的基因突變背景。對(duì)血清和組織標(biāo)志物的探索和研究最終將導(dǎo)致這一致死性疾病的早期診斷和較好的早期治病策略。經(jīng)典的病理學(xué)和特征指標(biāo)僅僅部分能夠檢測(cè)個(gè)體腫瘤的臨床行為(特征)，新的分子檢測(cè)和方法將不得不加入到以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)的診斷過(guò)程中。在科學(xué)發(fā)展的契機(jī)下，多學(xué)科交叉有利于與對(duì)這一疾病的早期診斷、預(yù)防和預(yù)后預(yù)測(cè)，這種綜合模式與中醫(yī)辨證論治思想在某些方面有相同之處，或可為中醫(yī)對(duì)疾病整體觀與微觀辨證之間的關(guān)系架起研究的橋梁，從而發(fā)展建立客觀可行的中醫(yī)辨證模式，亦是中醫(yī)傳承和創(chuàng)新發(fā)展的重要手段。為中醫(yī)診斷體系的建立、特別是為未來(lái)HCC中醫(yī)藥定靶治療帶來(lái)希望。