趙海霞 孟慶月 李 濤

（1銀川能源學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院；2寧夏伊品生物科技股份有限公司，寧夏 永寧 750100）

由灰葡萄孢菌侵染引起的葡萄灰霉病每年可造成葡萄高達(dá)50%的產(chǎn)后損失。用生物防治的手段來控制灰霉病己經(jīng)逐漸發(fā)展成為一條重要且有潛力的防治途徑。本研究針對寧夏當(dāng)?shù)爻Ｒ姷募t提葡萄發(fā)病的果實中分離病原菌灰葡萄孢菌，并從葡萄根際表面土壤中對灰霉病病原菌的拮抗菌株進(jìn)行了初步篩選，得到了8株拮抗效果較好的拮抗菌，為紅提葡萄灰霉病的生物防治提供有力的菌種支持。

1 材料與方法

1.1 材料

春季對寧夏永寧縣小任果業(yè)、銀川能源學(xué)院種植基地、銀川市西夏區(qū)軍馬場周邊葡萄園和寧夏農(nóng)業(yè)學(xué)校葡萄種植基地6個不同地區(qū)紅提葡萄根際土壤取樣，每個取樣地采5個樣本，將5個點的土壤混勻后，取50mg 3次重復(fù)保存共18份樣品進(jìn)行分離。

1.2 方法

1.2.1 葡萄灰霉病病原菌的分離。紅提葡萄病果表面用10%次氯酸鈉溶液浸泡3min后，無菌水沖洗3次，切取若干塊分別接種在PDA培養(yǎng)基上，22℃培養(yǎng)1～2d后，挑選與灰葡萄孢菌形態(tài)相似的單菌落，接到新的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直到菌落表現(xiàn)均勻一致為止。將純化后的灰霉病菌株標(biāo)記為“JD2016-8”且接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，22℃下培養(yǎng)3d后放到4℃冰箱保藏。

1.2.2 葡萄灰霉病菌拮抗菌的分離。稱取土壤10g加入90mL充分混勻，制成10-1土壤懸浮液，依次加無菌水稀釋制成10-2～10-6濃度梯度系列土壤懸液，分別取200μL涂布于清蛋白固體培養(yǎng)基上，每處理重復(fù)3皿。

1.2.3 葡萄灰霉病菌拮抗細(xì)菌、放線菌、霉菌以及酵母菌的分離培養(yǎng)和純化保存。將上述涂布接種完畢的培養(yǎng)皿，倒置28℃恒溫培養(yǎng)，2～4d開始挑菌，一直培養(yǎng)10d。細(xì)菌分離在培養(yǎng)24～48h開始，將單菌落轉(zhuǎn)接到NA培養(yǎng)基上，純化培養(yǎng)2次后斜面4℃保存。放線菌分離在培養(yǎng)5d開始，將單菌落轉(zhuǎn)接到高氏一號固體培養(yǎng)基進(jìn)行平板劃線培養(yǎng)，一般純化培養(yǎng)14d，待生長成熟后終止培養(yǎng)，4℃保存?zhèn)溆谩Ｃ咕蛛x在培養(yǎng)3d開始，將單菌落轉(zhuǎn)接到PDA固體培養(yǎng)基進(jìn)行平板劃線培養(yǎng)，純化培養(yǎng)2～3次后于4℃保存。酵母菌分離在培養(yǎng)3d開始，將單菌落轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基進(jìn)行平板劃線培養(yǎng)，純化培養(yǎng)2～3次后于4℃保存。

1.2.4 葡萄灰霉病菌拮抗真菌的篩選。將灰霉病病原菌在直徑9cmPDA固體培養(yǎng)基上活化，沿菌落邊緣用直徑5mm打孔器打孔，將菌餅置于空白PDA平板中央。培養(yǎng)皿四周呈“十”字形點接獲得的各拮抗菌液（108CFU/mL），距培養(yǎng)皿中心30mm，每處理重復(fù)3皿，設(shè)不接種菌液的相應(yīng)空白液體培養(yǎng)基處理為對照。28℃恒溫培養(yǎng)7d，觀察菌株的抑菌效果，對其在培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)進(jìn)行初步的形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.5 灰霉病孢子萌發(fā)和菌絲生長的抑制試驗。取葡萄灰霉病孢子懸浮液（106個/mL）20μL，加20μL拮抗菌發(fā)酵液，以0.5%葡萄糖液作對照，置無菌潔凈載玻片上，28℃培養(yǎng)8h后觀察孢子萌發(fā)，計算拮抗菌發(fā)酵液對病菌孢子萌發(fā)的抑制率；取灰霉病菌孢子懸浮液0.5mL加入PDA培養(yǎng)基中。將直徑為5mm滅菌濾紙片蘸上發(fā)酵液，以無菌水作對照，28℃恒溫培養(yǎng)3d后測量抑菌圈直徑，計算拮抗菌發(fā)酵液對菌絲生長的抑制率。

3 結(jié)果

3.1 病原菌的篩選和鑒定

從感染灰霉病的紅提葡萄果實表面，分離純化出1株病原菌，命名為JD2016-8。此菌株在PDA培養(yǎng)基上可以正常生長，生長溫度為22℃。菌絲生長初期為灰白色，貼著培養(yǎng)基生長，生長速度較快，5d左右可長滿培養(yǎng)皿，顯微鏡下觀察，病原菌分生孢子梗為灰褐色，有隔膜，頂端膨大，其上著生大量分生孢子，形似葡萄穗狀，分生孢子為單孢，近圓形或橢圓形，無色或淡色。按照《真菌鑒定手冊》，初步確定了JD2016-8為灰葡萄孢菌。

以病原菌JD2016-8基因組DNA為模板，利用真菌通用擴增引物ITS1（F）和ITS4（R）對病原菌JD2016-8進(jìn)行PCR擴增，目的條帶并進(jìn)行回收純化測序，該菌的ITS序列測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對分析，結(jié)合形態(tài)特征和ITS序列分析，確定是灰葡萄孢菌。

3.2 拮抗菌篩選結(jié)果

經(jīng)過對所采集的18份土壤樣品進(jìn)行梯度稀釋法分離，共篩選得到了64株不同菌株，其中細(xì)菌有20株，分離率占31.25%；放線菌有19株，分離率占29.69%；霉菌有15株，分離率占23.44%；酵母菌有10株，分離率占15.63%。采用平板對峙法對分離得到的上述64株不同菌株進(jìn)行拮抗性復(fù)篩，只有8株菌株表現(xiàn)出對灰霉病菌有抑制作用。其中，得到1株高效拮抗菌SW-W8，其發(fā)酵濾液抑菌圈直徑達(dá)25.5mm，其對葡萄灰霉病病菌孢子和菌絲的抑菌率分別為100%和13.17%。在復(fù)篩過程中，隨培養(yǎng)時間延長，菌株SW-W8對病原菌的拮抗作用幾乎不變。

3.3 拮抗菌初步鑒定結(jié)果

3.3.1 拮抗細(xì)菌：菌株NX-X3、JM-X8、JM-X17均在NA平板上生長，單菌落呈近圓形，邊緣整齊，半透明，表面光滑，中間有突起，近白色。革蘭氏染色結(jié)果表明，該菌株為革蘭氏陽性，芽孢呈橢圓形中生，菌體不具抗酸性，可產(chǎn)生異染粒，菌體生長物向四周呈云霧狀擴散。綜合菌株的形態(tài)特征和生理生化特性，對照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進(jìn)行檢索，初步鑒定為枯草芽孢桿菌。

3.3.2 拮抗放線菌：光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果表明，菌株NY-F5、SW-F9基內(nèi)菌絲無橫隔，不斷裂，氣生菌絲多分枝；孢子絲長，頂端呈2～3圈螺旋狀，分生孢子圓柱形。初步判斷菌株NY-F5、SW-F9菌體形態(tài)符合鏈霉菌屬特征，結(jié)合形態(tài)特征及參照《鏈霉菌鑒定手冊》方法進(jìn)行，參照《放線菌的分類和鑒定》初步鑒定為鏈霉菌。

3.3.3 拮抗霉菌：菌株NX-M2、JM-M6通過光學(xué)顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)菌絲生長緩慢，初期菌落表面平鋪，菌落稀疏，成熟區(qū)分生孢子區(qū)白色至灰綠色，菌絲無色，壁平滑，頂端不孕菌絲鞭狀，粗而長，厚垣孢子形成于菌絲交結(jié)處，偶爾在菌絲末端，分生孢子梗簇生。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，參照《真菌鑒定手冊》初步鑒定為木霉菌。

3.3.4 拮抗酵母菌：菌株SW-W8菌落為圓形、白色、不透明，表面光滑濕潤，中間隆起，邊緣整齊，不產(chǎn)生可溶性色素。通過光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)初步確定為酵母菌。

4 討論與展望

查閱大量相關(guān)文獻(xiàn)，灰霉病拮抗菌中拮抗細(xì)菌報道相對較多，NX-X3、JM-X8、JM-X17三株拮抗細(xì)菌在其他研究中已有大量相關(guān)資料；拮抗放線菌NY-F5、SW-F9；拮抗木霉菌NX-M2、JM-M6；拮抗酵母菌SW-W8相關(guān)研究資料相對缺少甚至無，對比不同拮抗菌的拮抗性能，下一步進(jìn)行田間生物防治效果研究工作，并通過分子生物學(xué)手段進(jìn)行菌種鑒定。