食源性微生物的分子檢測方法

張雪穎

（1.蘇州大學(xué) 江蘇蘇州 215123；2.劍橋-蘇大基因組資源中心）

1 前言

食源性病原微生物和腐敗有機(jī)體的生長對公共衛(wèi)生和食品工業(yè)都構(gòu)成了巨大的威脅。為了確保食品微生物的安全性和質(zhì)量，需要有效的檢測方法監(jiān)測原材料、食品加工環(huán)境和最終產(chǎn)品中的污染物。食品工業(yè)采用傳統(tǒng)的微生物檢測方法觀察人工培養(yǎng)基中細(xì)菌細(xì)胞的物理生長。但傳統(tǒng)方法費時費力，通常情況下最初的結(jié)果交付需要2～3 d，最終確認(rèn)需要10 d，這顯然給許多工業(yè)應(yīng)用帶來了不便，特別是在當(dāng)今的全球分銷市場上。分子技術(shù)的最新進(jìn)展使檢測和鑒別比傳統(tǒng)的方法更快、更方便、更靈敏、更特異。

分子檢測技術(shù)是基于對核酸的識別和擴(kuò)增。在過去的十幾年中，許多生物在公共領(lǐng)域獲得了大量的遺傳信息，為基于DNA/RNA的測試提供了有力地支持[1]。這些檢測方法很好地替代了傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （PCR）和核酸序列擴(kuò)增(NASBA)等方法為快速、特異、敏感地檢測食品中的微生物污染提供了很大的優(yōu)勢。此外，使用微陣列可以在一次檢測中同時檢測和鑒定多種病原體和基因。

2 熒光原位雜交

熒光原位雜交技術(shù)是利用特異性寡核苷酸探針直接從臨床、食品和環(huán)境樣品中檢測和鑒定特定微生物的方法。檢測時，用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)固定劑處理微生物細(xì)胞，并用寡核苷酸探針固定在載玻片上或溶液中。在嚴(yán)格洗滌以除去未結(jié)合的探針后，染色的細(xì)胞通過熒光顯微鏡被檢測到。熒光原位雜交技術(shù)特異性的關(guān)鍵是從靶細(xì)菌中選擇一種獨特的寡核苷酸片段作為探針。毒力基因經(jīng)常被用作探測目標(biāo)來檢測食源性病原體，因為它們通常在特定組中是保守的。通過使用核糖體RNA作為靶標(biāo)，大大提高了熒光原位雜交檢測的靈敏度[2]。

3 常規(guī)PCR

PCR是由Kary Mullis于1983發(fā)明的一種DNA片段擴(kuò)增技術(shù),可以將一些拷貝的靶DNA擴(kuò)增至數(shù)千到數(shù)百萬拷貝的特定DNA序列。在微生物診斷PCR中，使用特異性引物擴(kuò)增目標(biāo)DNA片段。擴(kuò)增產(chǎn)物的存在表明測試樣本中存在微生物。常規(guī)PCR方法在瓊脂糖凝膠上用電泳和溴化乙錠染色法顯示擴(kuò)增產(chǎn)物。有時為了進(jìn)一步確認(rèn)，需要進(jìn)行Southern印跡等分析，用來區(qū)分真正的放大分子和非特定的最終產(chǎn)品。自出現(xiàn)以來，PCR被認(rèn)為是分子生物學(xué)領(lǐng)域最重要的研究成果。PCR具有特異性、敏感性、快速性和準(zhǔn)確性等優(yōu)點。然而，常規(guī)PCR進(jìn)行食品微生物檢測時存在若干缺陷：首先，由于低水平的污染病原體或抑制酶反應(yīng)的殘留食物成分可能獲得假陰性結(jié)果；其次，僅存在于實驗室中的偶然DNA的非特異性擴(kuò)增或來自于死亡細(xì)胞的DNA碎片可導(dǎo)致假陽性檢測[3]；最后，傳統(tǒng)的PCR不能充分量化，食品行業(yè)對PCR的需求也在不斷增長。

4 實時PCR

實時PCR技術(shù)的發(fā)展是PCR檢測技術(shù)的重大進(jìn)步。實時PCR在每個復(fù)制周期中都包含熒光探針，從而使用光學(xué)模塊進(jìn)行監(jiān)測。它可以快速、動態(tài)地評估PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，減少外來核酸的污染。SYBR Green、分子信標(biāo)和Taqman探針是3種主要的實時PCR形式。

SYBR Green是一種高度特異性的雙鏈DNA結(jié)合染料，當(dāng)它被添加到PCR產(chǎn)物中時，會嵌入雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物中。SYBR Green實時PCR是所有實時PCR檢測中最經(jīng)濟(jì)、最簡單的選擇。然而，所有雙鏈核酸片段，包括引物二聚體，都能與SYBR Green結(jié)合并產(chǎn)生熒光信號[4]。

分子信標(biāo)實時檢測采用單鏈寡核苷酸探針檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。該探針形成莖-環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并用熒光團(tuán)和猝滅劑標(biāo)記。環(huán)路序列與擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)，通過退火位于探針序列任一側(cè)的互補(bǔ)臂序列形成莖。分子信標(biāo)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)是封閉的。將信標(biāo)環(huán)與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交迫使莖區(qū)開放，誘導(dǎo)檢測到的熒光信號。如果沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，則莖保持閉合且猝滅劑組分吸收熒光信號[5]。

在Taqman實時PCR中，用5’熒光報告染料和3’猝滅染料標(biāo)記探針進(jìn)行信號檢測。最初，探針與模板退火，由報告染料發(fā)射的熒光信號被附近的猝滅染料吸收。隨著擴(kuò)增過程的進(jìn)行，寡聚探針的互補(bǔ)序列被聚合酶的5’外切酶活性酶解，而游離的報告染料發(fā)出信號。猝滅染料距離太遠(yuǎn)，無法吸收熒光信號，使來自報告染料的信號被光學(xué)模塊捕獲。

實時PCR系統(tǒng)，特別是Taqman實時PCR是檢測食品樣品中細(xì)菌、真菌和病毒污染的領(lǐng)先技術(shù)。通過將PCR最終產(chǎn)物與寡核苷酸探針雜交，實時PCR提供了較高的速度和特異性。實時PCR還可以獲得具有有限操作和擴(kuò)增產(chǎn)物污染的結(jié)果。利用不同的引物和探針組合，實時PCR能夠同時識別同一反應(yīng)中的多種生物或多種基因。此外，實時PCR結(jié)果是定量的。模板DNA拷貝數(shù)可以確定，因為相對熒光單位(CT值)記錄在每個放大周期。然而，如上所述，實時PCR的主要限制之一是無法區(qū)分活細(xì)胞和非活細(xì)胞。

5 DNA微陣列

DNA微陣列是排列有數(shù)千個寡核苷酸點或cDNA探針的玻璃或硅芯片。待分析的靶DNA分子與陣列上的識別探針雜交。由陣列上的綁定目標(biāo)生成的信號允許基于探針的已知信息進(jìn)行識別。該技術(shù)可以允許單個小陣列測定中平行鑒定和表征以千計的寡核苷酸。一般而言，DNA微陣列實驗設(shè)計和典型的步驟包括：（1）寡核苷酸探針合成；（2）陣列制備；（3）樣品制備；（4）檢測雜交；（5）掃描和檢測；（6）數(shù)據(jù)分析[6]。

對于食品微生物分析，寡核苷酸芯片為多種毒力基因提供了高通量分析，同時檢測多種食源性致病菌。用于食品微生物分析的芯片初始應(yīng)用由食品藥品監(jiān)督局（FDA）完成，在各種毒力因子的基礎(chǔ)上鑒定腸道食品病原體。近年來，DNA微陣列技術(shù)已被用于檢測單個或多種病原體，如李斯特菌、金黃色葡萄球菌、空腸彎曲菌、志賀菌、大腸桿菌和沙門菌。一般來說，核糖體RNA編碼基因和各種毒力基因用于細(xì)菌鑒定。通常，擴(kuò)增靶生物體的特定片段，然后通過雜交微陣列進(jìn)行鑒定。PCR擴(kuò)增最初用于提高檢測靈敏度和降低非特異性背景DNA的噪聲，從而使復(fù)雜樣品中的低計數(shù)病原體細(xì)胞得以檢測[7]。

微陣列需要昂貴的設(shè)備，且對病原體的計數(shù)也很有限。然而，微陣列是快速的、特異性的，具有高樣品體積，并能同時檢測多種病原體?；谖㈥嚵械臋z測方法的優(yōu)勢使其優(yōu)于許多技術(shù)，成為食品微生物檢測的潛力股。

6 食源性微生物的分子檢測方法的局限性

與常規(guī)培養(yǎng)和免疫技術(shù)相比，分子檢測方法具有明顯縮短檢測時間的優(yōu)勢。它們還提供半定量信息，并確保敏感檢測復(fù)雜食品基質(zhì)中的特定目標(biāo)。盡管有這些優(yōu)點，分子方法在食品分析中的應(yīng)用是有限的。一個原因是殘留食物成分的干擾和食品樣品中常見的低水平污染物產(chǎn)生的假陰性[8]。例如，之前在牛奶中的研究已經(jīng)證明了分子檢測方法的局限性：牛奶中存在的蛋白酶抑制了降解Taq聚合酶的PCR；鈣離子通過改變反應(yīng)的緩沖能力阻礙了擴(kuò)增。通過使用內(nèi)部陽性對（IPC）可以發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增抑制劑的存在。IPC是精確已知量的核酸片段，其被添加到反應(yīng)中并與靶序列共同擴(kuò)增。如果沒有信號或微弱的放大信號由IPC產(chǎn)生，則可以抑制和檢測效率。

如上所述，分子檢測方法的缺點是靶向DNA分子不能區(qū)分活細(xì)胞和非活細(xì)胞。這在食品安全和質(zhì)量控制中尤為重要，因為只有活細(xì)胞才有可能構(gòu)成潛在風(fēng)險。當(dāng)前亟需適當(dāng)?shù)男路椒ɑ驅(qū)σ阎肿臃椒ǖ母倪M(jìn)對食品中的活細(xì)胞進(jìn)行快速檢測。