龍再浩 馬思杰 羅 潔

（寧波國際旅行衛(wèi)生保健中心 浙江寧波 315012）

1 前言

藥物殺蟲劑（包括菊酯）長期使用會誘導昆蟲出現抗性?？剐援a生是昆蟲適應環(huán)境并不斷進化的結果，抗性產生涉及復雜機制，如細胞色素P450s、鈉離子通道等。本文主要就細胞色素P450s在病媒昆蟲（蚊、蜚蠊和蠅）菊酯抗性機制研究進展進行綜述。

2 昆蟲P450s功能

細胞色素P450s組成自然界最大的超基因家族，發(fā)揮廣泛生理功能。昆蟲體內發(fā)現超過300種P450s，分布于70種已知P450超基因家族中27個CYP家族。比如，在黑腹果蠅基因組鑒別出90個P450基因，屬于25個家族；岡比亞按蚊基因組鑒別出111個P450基因。昆蟲體內P450s分布呈現出發(fā)育和特異性組織表達的多樣性。有些P450s出現在生命所有階段，如CYP4D1、CYP6A；有些顯著年齡特異性表，如 CYP6B1、CYP6B2、CYP6B3、CYP6D1 和 CYP6L1，還有某些P450s僅在某些組織中能表達[1]。

昆蟲體內細胞色素P450s最主要的功能是解毒/激活化合物。它是內源性化合物（信息素、蛻皮激素、保幼激素等）生物合成和降解通路的重要組成部分，可調節(jié)昆蟲生長、發(fā)育和繁殖；也是外源性化合物最主要代謝酶，包括藥物、殺蟲劑、植物毒素、化學致癌物和突變物等。昆蟲代謝或解毒有毒物質能力的差異，也就產生了抗性?？剐詫τ诶ハx生存，尤其是在化合物不利的環(huán)境下至關重要。研究認為，昆蟲抗性產生是復雜的，涉及多種作用機制，包括電壓門控鈉離子通道、P450代謝酶、有機磷代謝酶、谷胱甘肽-s-轉移酶等。過去研究發(fā)現抗性昆蟲體內存在多個P450s基因過表達或誘導表達情況，證實P450s是昆蟲產生包括菊酯類殺蟲劑抗性的原因[2，3]。應用轉錄組學等技術證實P450s在多種抗性昆蟲作用，包括蚊、蠅和蜚蠊等。

3 P450s菊酯抗性基因

3.1 P450s基因在菊酯抗性證據

研究已證實P450s是昆蟲產生菊酯抗性主要原因之一，有些情況可能是決定因素。研究應用協同劑PBO（細胞色素P450單胺氧化酶抑制劑）、DEF（水解酶抑制劑）和DEM（GST酶抑制劑），比較有無協同劑條件下昆蟲對氯菊酯抗性變化。結果顯示，PBO能顯著降低家蠅、蚊蟲和德國小蠊對氯菊酯的抗性系數，證實P450s解毒作用是昆蟲菊酯抗性產生的主要機制[4]。Hardstone等[5]通過回交方法把菊酯抗性淡色庫蚊與敏感品系交配產生新品系蚊蟲，該品系在遺傳基礎上將kdr（擊倒抗性）分離，保留P450抗性，結果新品系抗性系數仍高達1 600倍。該研究揭示P450機制是該品系蚊蟲產生氯菊酯抗性最主要原因。Estep等[6]報道菊酯抗性埃及伊蚊中存在P450過表達和鈉離子通道突變等，應用PBO證實P450s解毒作用約占抗性產生一半原因。進一步研究發(fā)現抗性昆蟲體內有一個以上P450s基因過表達/誘導增加情況，有時還有表達減少情況，揭示多個P450s基因相互作用是昆蟲抗性產生原因之一。Yang等[7]應用全基因組測序方法比較研究致倦庫蚊氯菊酯抗性群和敏感群體內204個P450基因表達譜差異，結果發(fā)現幼蟲有11個基因上調和5個下調，成蟲有7個基因上調和4個下調，其中，CYP6AA7和CYP4C52V1上調，CYP6BY3下調，證實蚊蟲抗性產生是多個P450基因共同作用結果。Li等[8]對多殺蟲劑抗性家蠅的全轉錄組進行分析，證實了多個P450s基因上調是家蠅產生高水平抗性的原因。

3.2 CYP4抗性基因

CYP4家族在細胞色素P450s基因中的數量最多，有多個基因被證實與菊酯抗性有關。Muller等[9]研究報道岡比亞按蚊氯菊酯篩選群與初始群比較，CYP4H19和CYP4H24是輕度過表達（＜2倍）。研究顯示，在昆蟲發(fā)育不同階段中P450s抗性基因表達是有差異。Pridgeon等[10]比較研究氯菊酯和溴氰菊酯抗性和敏感德國小蠊CYP4G19表達水平，蟲卵表達水平無差異，幼蟲期有1.7倍差異，成年期表達水平有5倍差異。Shen等[11]報道了溴氰菊酯抗性成年淡色庫蚊 CYP4H21、CYP4H22、CYP4H23、CYP4J4 和 CYP4J6是過表達。研究還發(fā)現這些基因在幼蟲時沒有上調。Komagata等[12]報道研究中菊酯抗性致倦庫蚊有多個P450s抗性基因，其中，包括CYP4基因過表達CYP4D40、CYP4H34（8.3倍），同時過表達基因還有CYP9M10（264 倍）、CYP6Z10（3.9 倍）和 CYP6M12。

3.3 CYP6抗性基因

目前已在多種抗性昆蟲體內發(fā)現CYP6基因族多個基因與昆蟲菊酯抗性相關，如CYP6A1(抗性家蠅）、CYP6A2（抗性果蠅）、CYP6D1（抗性家蠅）和CYP6F1（抗性致倦庫蚊）。Scott等[13]報道菊酯抗性家蠅體內除了鈉離子通道突變位點外，還發(fā)現CYP6D1過表達。Pan等[14]對菊酯抗性家蠅體內過表達CYP6D1基因進一步研究時發(fā)現了一個新的CYP6D1等位基因（CYP6D1v1）。 Ishak等[15]應用微陣列轉錄組技術發(fā)現白蚊伊蚊產生菊酯抗性與CYP6P12過表達和降低表皮穿透能力有關，而且表達CYP6P12轉基因果蠅獲得菊酯抗性進一步證實CYP6P12抗性作用；缺乏kdr突變菊酯抗性昆蟲CYP6P12過表達。Mao-Qing Gong等[16]研究報告在菊酯抗性淡色庫蚊中有CYP6F1過表達，Kasai等[17]報道在氯菊酯抗性致倦庫蚊的幼蟲發(fā)現CYP6F1轉錄增強，Komagata等[18]對同品系菊酯抗性致倦庫蚊種群中沒有發(fā)現CYP6F1表達增加，提示CYP6F1是否參與抗性還不明確。Dusfour等[19]研究報告在溴氰菊酯抗性埃及伊蚊發(fā)現多個P450基因上調表達，有CYP6BB2、CYP6M11、CYP6N12、CYP9J9、CYP9J10 和 CCE3，還發(fā)現電壓依賴鈉離子通道突變位點I1016和C1534。在菊酯抗性岡比亞按蚊體內發(fā)現CYP6Z亞家族中3個P450s基因（CYP6Z1、CYP6Z2 和 CYP6Z3）顯著過表達，但是沒有證實具有代謝菊酯能力[20，21]。從南部貝寧和尼日利亞地區(qū)多種菊酯抗性岡比亞按蚊體內發(fā)現CYP6P3和CYP6M2顯著增高[22-24]。

3.4 CYP9抗性基因

CYP9基因族中也發(fā)現CYP9A12、CYP9M10等基因與昆蟲的菊酯抗性密切相關。Strode等[25]開展針對菊酯抗性埃及伊蚊CYP9基因組學表達研究發(fā)現37個基因中至少有13個是過表達。Yang等[26]研究發(fā)現氰戊菊酯抗性品系棉鈴蟲蛾體內P450基因中 CYP9A12（433 倍）和 CYP9A14（59 倍）是高度過表達。Ishak等[27]研究報道應用基因組微陣列轉錄組技術分析檢測菊酯抗性埃及伊蚊基因表達圖譜，總共發(fā)現有204個基因過表達，包括谷胱甘肽-s-轉移酶、膽堿酯酶等，其中，過表達P450s基因有CYP9J27、CYP6CB1、CYP9J26 和 CYP9M4，CYP9J27 表現出高度基因多態(tài)性。Komagata等的研究發(fā)現菊酯抗性致倦庫蚊JPal-per品系幼蟲期抗性水平非常高，是敏感群的29 000倍，成年期抗性相對較低。研究發(fā)現該品系蚊子體內CYP9M10和CYP4H34表達水平在幼蟲階段都是最高，在蛹和成年期表達水平就急劇降低，其中，Jpal-per種群體內CYP9M10表達水平是敏感組過表達水平264倍。Gong等[28]還發(fā)現CYP9M10和CYP6AA7導致氯菊酯抗性與細胞色素P450還原酶（CPR）相關，應用CYP9M10或CYP6AA7與CPR共表達Sf9細胞，檢測發(fā)現細胞對氯菊酯及其代謝物代謝能力增強，從而提高細胞對氯菊酯的耐受性。

4 P450s抗性調節(jié)機制

4.1 GPCR/Gαs/ACs/cAMP/PKA調節(jié)

既往研究已證實，多個P450s抗性基因共同相互作用參與了昆蟲菊酯抗性的形成，影響昆蟲P450s抗性基因的表達。研究報道昆蟲P450s抗性基因調節(jié)是通過順式/反式作用元件的方式，G蛋白偶聯受體（GPCR）/Gαs（Gsα 亞單位蛋白）/ACs（腺苷酸環(huán)化酶）/cAMP/PKA（蛋白激酶A）信號傳導通路在P450s抗性基因調節(jié)起重要作用。Li等[29]報道視紫紅質G蛋白偶聯受體參與P450s抗性基因表達調節(jié)。在抗性致倦庫蚊中敲低視紫紅質樣GPCR基因會降低對氯菊酯抗性，同時會減少2種CAMP依賴蛋白激酶和4種P450抗性基因表達。視紫紅質轉基因果蠅具有氯菊酯抗性和P450抗性基因表達增加。GPCR信號傳導系統第二信使cAMP和下游效應器PKA也參與了P450s抗性基因調節(jié)。抑制cAMP產生會顯著降低4種p450抗性基因（CYP9 M10、CYP6AA7、CYP9J34和CYP9J40）和2種PKA基因的表達，降低蚊蟲對氯菊酯的抗性。敲低PKA基因對蚊蟲氯菊酯抗性和P450基因表達會產生同樣效果。GPCR/cAMP/PKA調節(jié)通路負責P450基因表達和P450調節(jié)抗性在致倦庫蚊。進一步研究證實GPCR信號傳導通路的Gαs等成分也參與P450s抗性基因調節(jié)。Li等應用RNAi和基因敲低技術研究氯菊酯抗性致倦庫蚊體內G蛋白偶聯受體細胞內信號傳導成分Gαs、ACs在P450s調節(jié)菊酯抗性機制作用。研究發(fā)現，敲低Gαs能引起下游效應器ACs、PKA和抗性P450基因表達水平，同樣敲低ACs也會減少PKA和P450s抗性基因表達。研究也發(fā)現無論敲低Gαs或ACs都會增強蚊蟲對氯菊酯的敏感性。時間和空間動力學分析表明Gαs、ACs and PKAs主要高度表達在腦部。P450s抗性基因主要表達在腦、中腸和馬氏管，表明其在中樞神經系統中發(fā)揮作用[30]。

4.2 piRNAs和MicroRNAs

piRNAs是一類新的非編碼單鏈RNA，具有生殖細胞維持、腦發(fā)育、表觀遺傳調節(jié)癌癥和抗病毒功能。研究顯示piRNAs通過與CpCYP307B1結合實現調節(jié)P450s抗性基因表達。Ye等[31]研究發(fā)現piRNA-3878與淡色庫蚊菊酯抗性相關，溴氰菊酯抗性淡色庫蚊體內表達水平低。過表達piRNA-3878能增強抗性品系敏感性，抑制表達則增加抗性。CpCYP307B1是piRNA-3878靶點，下調CYP307B1表達能增加蚊蟲死亡率。

miRNAs是在轉錄后基因表達調控發(fā)揮作用，研究顯示它也參與P450s抗性基因表達調控。Tian等[32]研究發(fā)現溴氰菊酯抗性品系淡色庫蚊種MiR-285顯著上調，微注射miR-285增加蚊子對溴氰菊酯處理的生存率。CYP6N23是MiR-285靶點，溴氰菊酯抗性品系中發(fā)現CYP6N23低表達，通過RNAi干擾技術微注射針對CYP6N23或MiR-285類似物，在下調CYP6N23表達同時降低蚊子死亡率。

4.3 CYP9M10

目前對CYP9M10抗性基因調控方式研究較為透徹。CYP9M10通過CuRE1調節(jié)昆蟲菊酯抗性，并且高表達CYP9M10單體型（強菊酯抗性）還與基因重復和順式作用突變相關。Itokawa等[33]研究蚊蟲過表達CYP9M10mRNA單體型中發(fā)現在轉錄起始位點（TSS）上游0.2kb區(qū)域插入一個轉座元件CuRE1，并且含有CuRE1插入比沒有插入CYP9M10表達水平高。對CYP9M10深入研究發(fā)現表達水平最高CYP9M10單體型（即抗性最高）基因組包含100 kb大小串連重復序列，其包含CYP9M10基因座，表達水平是不含重復序列的7.6倍[34]。出現重復序列被認為與位于CYP9M10啟動子核心區(qū)域發(fā)生的單核苷酸置換有關，Iotkawa等[35]應用熒光素酶報告基因技術發(fā)現，核苷酸（G-27A）突變增加2倍表達水平；相反，刪除包含該位置核苷酸的7 bp AT富裕序列，會抑制轉錄啟動。

5 結語

昆蟲抗性是昆蟲適應殺蟲劑環(huán)境而出現的一種復雜進化機制，P450s作用機制只是其中一部分。深入研究和理解昆蟲抗性發(fā)生分子機制，對發(fā)現有效抗性分子標志物和研制新型有效殺蟲劑、改善有害昆蟲的綜合措施具有積極的指導意義。