陸彩霞，孫曉梅，王文廣，匡德宣，李娜，仝品芬，李明學，代解杰*

(1. 中國醫(yī)學科學院/北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所樹鼩種質資源中心； 2. 中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所實驗樹鼩標準化與應用研究省創(chuàng)新團隊, 昆明 650118)

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)是一群來源于骨髓組織中的非造血細胞，具有自我更新和多向分化潛能的細胞[1]。BM-MSCs特性穩(wěn)定，易于獲得及擴增，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能；能夠與各種病毒載體結合，進行各種基因的轉染，既能保持本身基因的穩(wěn)定性，還能高效表達所轉染的基因[2]。

Cluster designation 81(CD81)是四次跨膜蛋白超家族成員之一[3]，研究發(fā)現，CD81是HCV入胞的受體，通過與HCV E2結合，使HCV吸附在細胞表面，在HCV入胞的早期階段發(fā)揮作用。 Occludin(OCLN)是構成緊密連接的組成成分之一，在進化上保守，小鼠、人類和犬的OCLN基因有90%的同源性[4-5]。Dorner等[6]將表達人HCV受體CD81、SR-BI、Claudin-1、和OCLN的重組腺病毒載體靜脈注射小鼠后，使小鼠獲得了對HCV-CRE的感染，并證實能表達CD81和OCLN的動物都能成功感染HCV-CRE。國內外很多學者將這些受體轉染非肝源性細胞，發(fā)現這些原本無法被HCV感染的細胞獲得了HCV易感性[6-8]，從而認為CD81和OCLN是HCV入胞的兩個最為關鍵的受體[6]。

樹鼩(tree shrew,TupaiaBelangeri)是比大小鼠等嚙齒類動物更接近非人靈長類的動物[9]，樹鼩的CD81和OCLN與人類CD81和OCLN同源性分別達93%和88%[10]。樹鼩作為一種新型實驗動物，在生物醫(yī)學研究中的應用范圍越來越廣，可用于肝炎病毒、柯薩奇病毒、單純皰疹病毒等病毒類疾病的研究和阿爾茨海默、抑郁癥等神經系統(tǒng)疾病的研究[11-15]。利用樹鼩BM-MSCs開展慢病毒載體介導HCV受體(OCLN/CD81)基因轉染實驗，研究轉染后對樹鼩BM-MSCs生物學特性的影響和受體的表達情況，為下一步利用樹鼩BM-MSCs開展HCV研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

F1 代成年普通級樹鼩，雌雄不限，體重 110～130 g，來自中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所樹鼩種質資源中心【SCXK(滇) K2013-0001】，實驗在中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所進行【SYXK(滇) K2013-0001】。所有操作均符合中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所動物倫理審查的要求(倫理審批號：醫(yī)科生倫字[2016]7號)。

1.1.2 實驗試劑

人淋巴細胞分離液(天津灝洋生物制品有限公司)、DMEM/F12(Thermo，美國)、高糖DMEM(HyClone，美國)、胎牛血清(Thermo)、地塞米松(Enzo)、3-異丁基-甲基黃嘌呤(IBMX)、胰島素、吲哚美辛(Sigma)、噻唑藍(MTT)、DMSO(Sigma)、茜素紅(Solarbio)、BMP-2(PeproTech，美國)、油紅O(Sigma)、RNAzol(MRC，cat.no:RN 190)、All-in-OneTM First-Strand cDNA Synthesis Kit(GeneCopoeia，cat.no:AORT-0020)、All-in-OneTM qPCR Mix(GeneCopoeia，cat.no:AORT-0020)、胰酶、肝素鈉、青霉素、鏈霉素、4%多聚甲醛、CCK-8試劑盒(碧云天生物技術)。

1.1.3 實驗儀器

倒置熒光顯微鏡(Nikon Ti，日本)、二氧化碳孵箱(Thermo，美國)、酶標儀(BioTek，美國)、細胞自動計數儀(Bio-Rad，美國)，流式細胞儀(BD Accuri C6，美國)，實時熒光定量儀(Bio-Rad，美國)，小型離心機(CT15RE，日本)，垂直電泳槽(Bio-Rad，美國)、半干轉膜儀(Bio-Rad，美國)、水平脫色搖床、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)。

1.1.4 BM-MSCs細胞

由本實驗室分離鑒定保存，具體方法見我們之前的報道[11]。

1.2 方法

1.2.1CD81和OCLN慢病毒載體的構建

構建過表達人CD81(NM_004356.3)和OCLN(U53823.1)慢病毒載體，分別含有GFP和RFP熒光，標記為LV-CD81和LV-OCLN。病毒滴度測定采用稀釋計數法，制備好的慢病毒載體置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 慢病毒載體轉染樹鼩BM-MSCs

采用1/2小體積感染法，即取P3代樹鼩BM-MSCs以5×104個/mL接種6孔板，待第二天細胞長至約60%匯合時，吸去舊培養(yǎng)基，加入1/2體積新鮮培養(yǎng)基。按MOI=100，換算為對應的病毒原液體積，并按體積將病毒原液加入細胞中，搖勻，置于37℃、5% CO2孵箱中感染4 h后取出細胞，直接往含病毒的培養(yǎng)基中加入另外1/2體積的新鮮培養(yǎng)基。感染后第2天，吸去含病毒的培養(yǎng)基，換上新鮮的培養(yǎng)液，繼續(xù)37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。感染72 h后，進行熒光顯微鏡拍照和流式細胞儀分析感染效率。

1.2.3 流式細胞儀(FACS)分析慢病毒感染效率

將慢病毒感染72 h后的BM-MSCs細胞用0.25%的胰蛋白酶溶液消化，用基礎培養(yǎng)基混懸細胞，收集于1.5 mL的EP管中，3500 r/min離心3 min，棄上清。添加0.1% BSA-PBS 1 mL混懸細胞，3500 r/min離心3 min，棄上清。添加4% formaldehyde 100 μL，再添加PBS 400 μL?；鞈壹毎螅瑢⒓毎D移至上樣管中，上機分析樣品。

1.2.4 慢病毒轉染后樹鼩BM-MSCs生長曲線測定

將慢病毒感染后的樹鼩BM-MSCs及未感染慢病毒的對照組第3代樹鼩BM-MSCs用0.25%胰蛋白酶溶液消化后制成單細胞懸液。取10 μL細胞與臺盼藍染液按1∶1混勻后，再取10 μL加入到細胞計數板，將細胞計數板插入到伯樂細胞計數儀上計數，按細胞密度為4×104個/mL接種96孔細胞板，每孔取200 μL， 每組每個時間點設3個復孔，放入37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)的1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d檢測各組細胞光密度值。檢測前，吸走原有培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK-8溶液與100 μL培養(yǎng)基混合液，在培養(yǎng)箱孵育4 h。酶標儀(450 nm)讀取各孔光密度(OD)值，并繪制細胞生長曲線。

1.2.5 慢病毒轉染后樹鼩BM-MSCs向脂肪細胞誘導

將感染慢病毒的BM-MSCs用0.25%胰蛋白酶溶液消化后制成單細胞懸液，細胞計數后按照2×104個/mL接種于12孔板中，每孔1 mL，常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞生長匯合至80%左右時，更換培養(yǎng)基為成脂誘導液(DMEM/F12 + 100 U/mL青霉素 + 100 μg/mL鏈霉素溶液 + 10% FBS + 1 μmol/L地塞米松 + 0.2 mmol/L吲哚美辛 + 0.01 mg/mL胰島素 + 0.5 mmol/L IBMX)。放入37℃、5% CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔48 h換液。誘導2周后進行油紅O染色。

1.2.6 慢病毒轉染后樹鼩BM-MSCs向成骨細胞誘導

將感染慢病毒的BM-MSCs用0.25%胰蛋白酶溶液消化后制成單細胞懸液，細胞計數后按照2×104個/mL接種與12孔板中，每孔1 mL，常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞生長匯合至80%左右時，更換培養(yǎng)基為成骨誘導液(高糖DMEM + 50 ng/mL BMP-2 + 10% FBS + 100 U/mL青霉素 + 100 μg/mL鏈霉素溶液)。放入37℃、5% CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔48 h換液。誘導18 d后進行茜素紅染色。

1.2.7 慢病毒轉染后樹鼩BM-MSCs干性基因檢測

提取慢病毒轉染前后的樹鼩BM-MSCs總RNA，提取方法按MRC的“Trizol法提取總RNA”試劑盒說明書進行。用設計的LIN28A、NANOG、OCT4和SOX2引物(見表1)進行qRT-PCR定量檢測。干性基因相對表達量采用基因相對定量分析法(2-ΔΔCT法)，以GAPDH為內參基因。

1.2.8 慢病毒感染后CD81和OCLNmRNA表達檢測

細胞總RNA提取方法按MRC的“Trizol法提取總RNA”試劑盒說明書進行。用設計的CD81和OCLN引物(見表2)進行qRT-PCR定量檢測。CD81和OCLNmRNA表達量采用基因相對定量分析法(2-ΔΔCT法)，以GAPDH為內參基因。

表1 干性基因引物列表Table 1 Primer sequences

表2 CD81和OCLN引物列表Table 2 Primer sequences of CD81 and OCLN

1.2.9 慢病毒感染后CD81和OCLN 蛋白表達檢測

采用Western blot檢測CD81和OCLN蛋白表達水平。分別配置10%和12%的分離膠，取等量蛋白量(含細胞蛋白25 mg)上樣行電泳。電泳條件：濃縮膠恒壓80 V，20 min，分離膠恒壓 100 V，約60 min。轉膜后，置于5%的脫脂奶粉中，室溫封閉30 min。加入CD81和OCLN一抗，室溫孵育60 min。洗膜后加入二抗，室溫搖床上孵育1.5 h, 用1X TBST在室溫搖床上充分脫色后，用TBST洗膜，最后采用ECL底物化學發(fā)光法在凝膠成像系統(tǒng)顯色成像。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 CD81和OCLN 過表達慢病毒載體的構建

CD81和OCLN慢病毒陽性重組克隆均通過測序，證明載體構建成功。LV-CD81病毒滴度為1× 108TU/mL, LV-OCLN病毒滴度為3×108TU/mL。

2.2 含人 CD81和OCLN的慢病毒轉染效率

轉染72 h后，熒光倒置顯微鏡下觀察，在MOI=100時，可見熒光細胞幾乎滿視野，細胞呈條索狀(圖1)。流式細胞儀檢測LV-CD81轉染效率達99.4%，LV-OCLN轉染效率22.6%(圖2)。

2.3 含人 CD81和OCLN的慢病毒轉染對樹鼩BM-MSCs增殖能力的影響

P3代樹鼩BM-MSCs轉染含人CD81和OCLN分子的慢病毒后，均在3 d進入對數生長期，之后呈現下降趨勢，7 d又開始回升。轉染基因后細胞增殖的總體趨勢與未轉染基因的BM-MSCs相似(圖3)，但LV-OCLN組細胞增殖活力相對于未轉染組和LV-CD81組低。

2.4 慢病毒轉染樹鼩BM-MSCs后成脂誘導鑒定

BM-MSCs成脂誘導6 d后，鏡下可見細胞變圓變大，細胞內有小的脂滴形成，成“葡萄樣”改變，隨著培養(yǎng)時間的增加細胞內脂滴逐漸變大，誘導14 d后油紅O染色可見脂滴被染成紅色。正常對照組BM-MSCs紅色脂滴較轉染了慢病毒的BM-MSCs產生的脂滴多(圖4)。

2.5 慢病毒轉染樹鼩BM-MSCs后成骨誘導鑒定

慢病毒轉染BM-MSCs后成骨誘導18 d后進行茜素紅染色，鏡下可觀察到紅色結節(jié)，但成骨對照組紅色結節(jié)較轉染了慢病毒的BM-MSCs產生的紅色結節(jié)多(圖5)。

2.6 慢病毒轉染樹鼩BM-MSCs后干性基因檢測

未轉染組均表達干性相關基因LIN28A、NANOG、OCT4，不表達SOX2。LV-OCLN和LV-CD81轉染樹鼩BM-MSCs后，NANOG基因mRNA表達增高，差異有顯著性(P< 0.05)，LIN28A基因mRNA表達下降，差異有顯著性(P< 0.05)(圖6)。

2.7 慢病毒感染后CD81和OCLN mRNA表達

構建的含人CD81/OCLN慢病毒載體在轉染樹鼩BM-MSCs后，CD81和OCLN的mRNA表達均較未轉染組高表達，差異有顯著性(P< 0.05)(圖7)。

2.8 慢病毒感染后CD81和OCLN 蛋白表達

Western blot 結果顯示轉染組OCLN蛋白和CD81蛋白水平均高于未轉染組，差異有顯著性(P< 0.05)(圖8)。

注：A. 含人CD81慢病毒轉染BM-MSCs； B. 含人OCLN慢病毒轉染BM-MSCs。圖1 慢病毒轉染后熒光倒置顯微鏡觀察(×100)Note. A. LV-CD81-BM-MSCs. B. LV-OCLN-BM-MSCs.Figure 1 Detection of transfection efficiency of LV-OCLN and LV-CD81 by FACS using a fluorescence inverted microscope (×100)

注：A-B. 流式細胞儀檢測LV-OCLN轉染效率；C-D. 流式細胞儀檢測LV-CD81轉染效率。圖2 流式細胞儀檢測轉染效率Note: A-B. Detection of transfection efficiency of LV-OCLN by FACS. C-D. Detection of transfection efficiency of LV-CD81 by FACS.Figure 2 Detection of transfection efficiency of LV-OCLN and LV-CD81 by FACS

圖3 含人CD81和OCLN分子的慢病毒轉染后樹鼩BM-MSCs 的生長曲線Figure 3 Growth curve of tree shrew BM-MSCs transfected with CD81/OCLN lentiviral vector

注：A.成脂對照組；B. LV-CD81-BM-MSCs；C. LV-OCLN -BM-MSCs。圖4 慢病毒轉染樹鼩BM-MSCs后成脂誘導第14天后油紅O染色(×100)Note. A. Control group of adipogenic induction. B. LV-CD81 group of adipogenic induction. C. LV-OCLN group of adipogenic induction.Figure 4 Adipogenic induction of BM-MSCs after transfection with lentivirus at day 14 by oil red O staining (×100)

注： A. 成骨對照組； B. LV-OCLN -BM-MSCs； C. LV-CD81-BM-MSCs。圖5 慢病毒轉染樹鼩BM-MSCs后成骨誘導第18天后茜素紅染色(×100)Note. A. Control group of osteogenic induction. B. LV-OCLN group of osteogenic induction. C. LV-CD81 group of osteogenic induction.Figure 5 Osteogenic induction of BM-MSCs after transfection with lentivirus at day 18 by alizarin red staining (×100)

圖6 慢病毒轉染樹鼩BM-MSCs后干性基因檢測Figure 6 Pluripotency marker detection of BM-MSCs after transfection with lentivirus

圖7 慢病毒轉染后CD81和OCLN mRNA表達Figure 7 mRNA expression of CD81 and OCLN after lentivirus infection

注：A-C. 慢病毒轉染后OCLN蛋白表達；B-D. 慢病毒轉染后CD81蛋白表達。圖8 慢病毒轉染樹鼩BM-MSCs后CD81/OCLN基因的蛋白表達Note. A, C. The OCLN protein expression of BM-MSCs after transfection with lentivirus. B, D. The CD81 protein expression of BM-MSCs after transfection with lentivirus.Figure 8 CD81 and OCLN protein expression of BM-MSCs after transfection with lentivirus

3 討論

BM-MSCs起源于中胚層，除了可以向成骨細胞，脂肪細胞，心肌細胞，肝和膽道上皮細胞等中胚層細胞分化，同時又有向外胚層的神經元細胞和內胚層的肝卵圓細胞分化的潛力。BM-MSCs不涉及道德及倫理學方面的問題，且容易在體外培養(yǎng)，具有高度的擴增能力，能夠與各種病毒載體結合，進行各種基因的轉染，既能保持本身基因的穩(wěn)定性，還能高效表達所轉染的基因[2]。

基因轉染的方法有非病毒載體和病毒載體轉染兩種。病毒載體主要有逆轉錄病毒介導、慢病毒介導法、腺病毒介導以及腺相關病毒介導等，各有利弊。慢病毒可以感染分裂和不分裂的細胞，感染細胞時病毒基因組整合于宿主染色體上，能穩(wěn)定長期表達，免疫原性低，安全性較好，已成功感染了造血干細胞、神經細胞、胰島細胞、肝細胞、視網膜色素上皮細胞、肌肉細胞和氣道上皮細胞等[16-18]。腺病毒載體感染細胞時病毒基因組并不整合到染色體上，只瞬時表達外源基因，免疫原性高，反復應用易引起免疫反應[19]。蘇玉金等[20]報道慢病毒載體轉染SD大鼠BM-MSCs效率高于腺相關病毒轉染BM-MSCs(AAV轉染率為49.1%，LV轉染率為91.4%)。我們在實驗前期曾嘗試用腺病毒載體和Lipofectamine 2000脂質體介導轉染樹鼩BM-MSCs，但發(fā)現兩者的轉染效率都很低。而在用慢病毒轉染樹鼩BM-MSCs時，發(fā)現在感染復數(MOI)為100時， LV-CD81轉染效率達99.4%，LV-OCLN轉染效率22.6%，轉染效率的高低可能與所攜帶的外源基因的大小有關(CD81，711 bp，OCLN，1569 bp)。

武成聰等[21]在研究重組腺病毒在不同感染復數下轉染兔BM-MSCs，發(fā)現隨感染復數值的增加，BM-MSCs貼壁能力減弱，部分細胞老化、死亡，轉染效率在5%～12%之間。感染復數達250時，成骨分化潛能受到影響，最適感染復數為100。在我們的研究中發(fā)現，在不加入助轉劑(polybrene)時，含人OCLN/CD81慢病毒載體轉染樹鼩BM-MSCs的最適感染復數為100，細胞狀態(tài)良好，未出現死亡現象，轉染效率較高。助轉劑的加入可以降低病毒用量，同時提高轉染效率，我們發(fā)現在加入終濃度為4 μg/mL的助轉劑時，在MOI為30時，即可達到理想的轉染效率(數據未給出)。MOI為100時，轉染含人OCLN/CD81慢病毒載體后，樹鼩BM-MSCs生長曲線總體趨勢一致，但LV-OCLN組在生長后期出現增殖緩慢，推測可能與轉入的外源基因片段大有關。

在多向分化潛能上，轉染了含人OCLN/CD81慢病毒載體后，樹鼩BM-MSCs雖然依然能向成脂成骨誘導分化，但誘導的脂肪細胞和成骨細胞比未轉染組少。說明在MOI為100時，其多向分化潛能受到一定的影響。多向分化潛能性基因或干性維持基因(如LIN28A、NANOG、OCT4、SOX2)特定表達于具有多向分化潛力的細胞，對干細胞的多向分化具有調節(jié)作用， 其表達量隨著干細胞的分化而逐漸下降[22-24]。對成體干細胞的研究發(fā)現，隨著年齡的增長干細胞自身增殖及分化功能減退[25-26]，推測可能與干細胞的干性維持相關的基因表達下降有關[27-28]。Tsai 等[23]發(fā)現OCT4及NANOG基因在成體MSCs同樣高表達，而敲除OCT4 及NANOG基因后，MSCs 的增殖及分化均明顯下降，而自發(fā)性分化現象明顯增加。我們應用PCR技術評估了慢病毒載體介導的HCV受體基因OCLN/ CD81轉染對樹鼩BM-MSCs 內LIN28A、NANOG、OCT4、SOX2基因的表達情況，結果顯示SOX2在轉染和未轉染細胞中基本檢測不出來，可能是樹鼩BM-MSCs不表達該基因。OCT4表達量在轉染和未轉染細胞中表達量無顯著性差別，而NANOG表達量轉染組比未轉染組高，表達量有顯著性差異。LIN28A基因表達量轉染組比未轉染組低，差異有顯著性。這些差異的出現說明外源基因的導入，對樹鼩BM-MSCs干性相關基因的表達有一定的影響，這些變化也間接影響了其多向分化潛能。

構建的含人OCLN/CD81慢病毒載體在轉染樹鼩BM-MSCs后，CD81和OCLN的mRNA表達和蛋白表達均較未轉染組高表達，有顯著差異，說明我們構建的慢病毒載體能成功地轉染樹鼩BM-MSCs并表達轉入的外源基因，這為下一步在轉染HCV受體(OCLN/CD81)的樹鼩BM-MSCs上進行HCVcc相關感染實驗提供了基礎。