王露，王麗，劉曉燕，季星利，樊均明,4,5*

(1. 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科，四川瀘州 646000； 2. 西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究中心，四川瀘州 646000； 3. 西南醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究中心，四川瀘州 646000； 4. 西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院腎病內(nèi)科，四川瀘州 646000； 5. 成都醫(yī)學(xué)院，成都 610000)

慢性腎病(chronic kidney disease, CKD)患者往往伴有腸道功能紊亂[1]。腸黏膜上皮緊密連接(tight Junction, TJ)可以防止環(huán)境中的病原體和有害物質(zhì)入侵腸黏膜，并能阻止細(xì)胞間隙中物質(zhì)的滲出，是維持腸道功能正常運(yùn)行的基礎(chǔ)屏障。TJ是位于腸黏膜上皮細(xì)胞間的一個(gè)復(fù)雜的復(fù)合蛋白質(zhì)體系，主要由咬合蛋白 occludin、閉合蛋白 claudins 和連接黏附分子(junctional adhesion molecules, JAMs)三種完整的膜蛋白和閉合小環(huán)蛋白(ZO-1，ZO-2，ZO-3)等組成[2]。已有研究顯示，TJ的改變對(duì)腸道屏障功能障礙及其他相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要。CKD患者的腸道炎癥易感性和一些炎癥因子相關(guān)，如干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)以及白介素(interleukin, IL)等[2-3]。中醫(yī)藥治療在腎病領(lǐng)域的應(yīng)用有悠久的歷史，中藥中的黃芪[4]、當(dāng)歸[5]、三七[6]、大黃[7]等可用來(lái)改善腎功能，并通過(guò)固本培元、化瘀降結(jié)、通腑泄?jié)岬雀纳艭KD癥狀。黃芪三七合劑作為本課題組在臨床上用于治療CKD的一種常用藥方，由黃芪、三七、當(dāng)歸、懷牛膝、昆布、牡蠣、大黃、川穹和丹參組成，我們通過(guò)長(zhǎng)期臨床觀察已證實(shí)其對(duì)CKD治療的有效性，并在CKD大鼠上初步驗(yàn)證了其對(duì)受損腎功能的明顯改善作用，但確切機(jī)制不明[8]?；谀I與腸道密切相關(guān)的觀點(diǎn)，我們提出：中藥復(fù)方黃芪三七合劑可通過(guò)改善黏膜受損介導(dǎo)的慢性腎疾病進(jìn)而治療或延緩疾病進(jìn)展的假設(shè)。擬通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段，在分子生物學(xué)水平上探究黃芪三七合劑的作用機(jī)制，為研究中醫(yī)藥治療腎疾病提供現(xiàn)代證據(jù)，推動(dòng)慢性腎疾病研究的發(fā)展，具體研究報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡雄性 SD 大鼠30只，清潔級(jí)，體重(180±20)g，所有動(dòng)物由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供【SCXK(川)2015-030】，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK(川)2013-065】，大鼠分籠飼養(yǎng)，自然晝夜節(jié)律變化，室溫(23±2)℃，相對(duì)濕度 40%～60%，自由飲水，提供充足的飼料供給。實(shí)驗(yàn)經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(20170621)。

1.1.2 藥物與給藥

黃芪三七合劑含黃芪50 g(5.21 g/kg),三七10 g(1.04 g/kg)，當(dāng)歸10 g(1.04 g/kg),懷牛膝30 g(3.125 g/kg)，昆布30 g(3.125 g/kg)，牡蠣10 g(1.04 g/kg)，大黃6 g(0.625 g/kg)，川穹15 g(1.56 g/kg)，丹參15 g(1.56 g/kg)(均為生藥量)。括號(hào)內(nèi)為大鼠用藥量，實(shí)驗(yàn)采用中藥免煎顆粒購(gòu)自西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中藥房(批號(hào)：1711025)。按照大鼠每100 g取1.5 mL的灌胃量，用相應(yīng)蒸餾水混勻藥物，按1倍、2倍劑量等體積一日兩次給低、高劑量組大鼠灌胃一個(gè)月。尿毒清顆粒購(gòu)自康臣藥業(yè)有限責(zé)任公司(批號(hào)：Z20073256)。實(shí)驗(yàn)用藥均參照《中藥藥理學(xué)研究方法》按人和大鼠體重?fù)Q算得出。

1.1.3 試劑與儀器

TGF-β1抗體(美國(guó) Cell Signaling Technology公司)，α-SMA、IFN-γ和IL-6抗體(美國(guó) Boster公司)，ZO1、Occludin、Claudin-1抗體(美國(guó) eBioscince公司)，肌酐(Cr)試劑盒(肌氨酸氧化酶法)和尿素氮(BUN)試劑盒(脲酶法)(南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號(hào)20180201)，高速冷凍離心機(jī)(德國(guó) Eppendorf公司)，光學(xué)顯微鏡(日本 Olympus公司)，凝膠成像儀(美國(guó) Bio-rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立

隨機(jī)將SD大鼠分為假手術(shù)組(Sham)、模型組(I/R)、 黃芪三七合劑低劑量組(L-HSM)、黃芪三七合劑高劑量組(H-HSM)、尿毒清組(NDQ)5個(gè)組。正常喂養(yǎng)兩周后，術(shù)前禁食24 h,給予45 mg / kg戊巴比妥鈉麻醉，將大鼠施以右腎切除術(shù)，一周后，再次施行左腎缺血再灌注手術(shù)，缺血45 min，36.5℃，正常組只施行打開腹腔、縫合[9]。四周后分別給予黃芪三七合劑低劑量組(L-HSM)18 g/(kg·d)、黃芪三七合劑高劑量組(H-HSM)36 g/(kg·d)和尿毒清組(NDQ)1.56 g/(kg·d)灌胃處理,假手術(shù)組(Sham)、模型組(I/R)給予等體積蒸餾水灌胃，2次/日。

1.2.2 標(biāo)本制備

分別于造模后第二周、第四周尾靜脈采血和造模八周后采血，戊巴比妥鈉溶液45 mg/kg腹腔注射麻醉后，采用一次性采血管腹主動(dòng)脈采血，離心，留取上清，部分上清液送西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測(cè)，部分-80℃冰箱保存。采血完畢后，分別取回腸及結(jié)腸組織約4 cm，用生理鹽水洗凈腸內(nèi)容物，勿損傷腸黏膜。用組織剪各取0.5 cm放入4%多聚甲醛固定液中固定，其余放入液氮中凍存。快速取腎，去包膜，切割成塊，一部分4%多聚甲醛固定，另一部分液氮凍存。

1.3 樣本檢測(cè)

1.3.1 血清肌酐、尿素氮檢測(cè)

將血清離心取上清按照試劑盒步驟常規(guī)操作。

1.3.2 病理染色

按常規(guī)方法制備石蠟切片后，進(jìn)行常規(guī)脫蠟復(fù)水，抗原修復(fù)，封閉，一抗4℃過(guò)夜，酶標(biāo)二抗37℃孵育1 h，以上步驟后均用PBS洗3次，每次5 min，DAB顯色4 min，復(fù)染15 s，自來(lái)水沖洗，常規(guī)脫水、透明、封片。然后免疫組織化學(xué)染色觀察腸道ZO-1、Occludin和Claudin-1蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)免疫組化圖片進(jìn)行平均光密度檢測(cè)和分析。參數(shù)平均光密度代表目的蛋白的顆粒密度。

1.3.3 Western blot

將凍存的樣本組織稱取10 mg放入研缽中，加入少量液氮研磨，用預(yù)冷PBS緩沖液將組織吸入EP管中，其余各組采用同樣方式研磨組織。將得到的各組組織離心，4℃ 5000 r/min 5 min,得到的沉淀加入300 μL裂解液(含3 μL PMSF)，充分吹打混勻，超聲5 s，冰上裂解30 min,然后離心4℃ 12 000 r/min 30 min。將得到的蛋白測(cè)濃度，加入Loding buffer后95℃煮10 min,放-20℃凍存。配置10%的分離膠，依次進(jìn)行上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，TBST洗3次，每次5 min,孵一抗，4℃過(guò)夜，TBST洗3次，每次5 min,孵二抗，TBST洗3次，每次5 min，最后曝光,用Image J軟件分析條帶目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)的比較

大鼠造模2周時(shí)檢測(cè)其SCr和BUN均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；4周后，I/R組SCr和BUN明顯升高，SCr維持在36.67 μm/L左右，BUN維持在9.27 mmol/L左右，與Sham組相比差異有顯著性；8周后，I/R組SCr和BUN仍然顯著高于Sham組，H-HSM組則出現(xiàn)SCr和BUN降低(P< 0.05)，表明黃芪三七合劑可以有效降低SCr和BUN,改善腎功能。見(jiàn)表1所示。

2.2 各組大鼠腎α-SMA、TGF-?1蛋白的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示：與Sham組相比，α-SMA、TGF-β1蛋白在I/R組中表達(dá)明顯升高(均P< 0.01)；與I/R組相比，α-SMA、TGF-β1蛋白在黃芪三七合劑治療組表達(dá)明顯降低，其中H-HSM組降低表現(xiàn)的更甚，差異均有顯著性。如圖1所示。

2.3 各組腸組織炎癥因子IFN-γ和IL-6的表達(dá)

結(jié)果顯示：I/R組結(jié)腸組織炎癥因子IFN-γ和IL-6表達(dá)升高，表明模型組結(jié)腸處于高度炎癥狀態(tài)；經(jīng)黃芪三七合劑治療后，結(jié)腸組織的炎癥因子IFN-γ和IL-6表達(dá)顯著降低，表明黃芪三七合劑可有效降低結(jié)腸組織炎癥因子表達(dá)(見(jiàn)圖2)。

表1 大鼠造模4周和8周后大鼠血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)比較Table 1 Comparison of serum creatinine (SCr) and blood urea nitrogen(BUN) in rats of each group after 4 and 8 weeks of

注：與Sham組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與I/R組比較，#P< 0.05，##P< 0.01。

Note. Compared with the sham group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the I/R group,#P< 0.05,##P< 0.01.

注：與Sham組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與I/R組比較，#P< 0.05，##P< 0.01,(n=5)。圖2 Western blot檢測(cè)各組結(jié)腸組織炎癥因子IFN-γ和IL-6的表達(dá)Note. Compared with the sham group, *P< 0.05, **P< 0.01. Compared with the I/R group, #P< 0.05,##P< 0.01,(n=5).Figure 2 Expression of inflammatory cytokines IFN-γ and IL-6 in colonic tissue of each group detected by Western blot

2.4 免疫組化法檢測(cè)各組結(jié)腸緊密連接蛋白ZO1、Occludin和Claudin-1的表達(dá)

采用Image-Pro Plus 6.0分析軟件對(duì)免疫組化圖像進(jìn)行光密度檢測(cè)和分析，結(jié)果如圖3所示，棕色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域：與Sham組相比，I/R組結(jié)腸上皮ZO1、Occludin蛋白的表達(dá)降低，差異有顯著性，而L-HSM、H-HSM組和NDQ組出現(xiàn)不同程度升高的ZO1、Occludin蛋白表達(dá)，差異有顯著性，但Claudin-1蛋白的變化不明顯(見(jiàn)圖3, 表2)。

2.5 Western blot法檢測(cè)各組結(jié)腸組織中ZO1、Occludin和Claudin-1蛋白的表達(dá)

采用Image J分析條帶灰度值可知，與假手術(shù)組相比，模型組結(jié)腸組織緊密連接蛋白ZO1、Occludin和Claudin-1表達(dá)均降低，且差異有顯著性(P值分別為0.007、0.005和0.042)；而L-HSM組、H-HSM組和NDQ組均可不同程度的升高ZO-1和Occludin蛋白的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如圖4所示。

表2 各組結(jié)腸緊密連接蛋白ZO1、Occludin和Claudin-1的表達(dá)比較Table 2 Comparison of the expression of colonic tight junction proteins ZO-1, occludin, and claudin-1 in each group n=5)

注：與Sham組比較，*P< 0.05，**P< 0.01； 與I/R組比較，#P< 0.05，##P< 0.01。

Note. Compared with the sham group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the I/R group,#P< 0.05,##P< 0.01.

注：與Sham組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與I/R組比較，#P< 0.05，##P< 0.01。圖3 各組結(jié)腸緊密連接蛋白ZO1、Occludin和Claudin-1的表達(dá)(IHC，×200)Note. Compared with the sham group, *P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the I/R group, #P< 0.05, ##P< 0.01.Figure 3 Expression of colonic tight junction proteins ZO-1, occludin, and claudin-1 in each group (IHC, ×200)

注：與sham組比較：*P< 0.05，**P< 0.01；與I/R組比較：#P< 0.05，##P< 0.01，(n=5)。圖4 Western blot檢測(cè)各組結(jié)腸緊密連接蛋白ZO1、Occludin和Claudin-1的表達(dá)Note. Compared with the sham group, *P< 0.05, **P< 0.01. Compared with the I/R group, #P< 0.05, ##P< 0.01，(n=5).Figure 4 Expression of colonic tight junction proteins ZO-1, occludin, and claudin-1 detected by Western blot

3 討論

CKD是世界范圍內(nèi)的一個(gè)重大公共衛(wèi)生問(wèn)題，主要是由于腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化導(dǎo)致腎功能降低[10]。腎小球?yàn)V過(guò)率(glomerular filtration rate，GFR)的降低與腎間質(zhì)纖維化密切相關(guān)，故與腎纖維化發(fā)生、發(fā)展相關(guān)靶向因子和介導(dǎo)因子是延緩腎功能惡化和改善預(yù)后的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[11]。多項(xiàng)研究表示，改善腸道微環(huán)境可以減少血液中對(duì)腎有害的生物因子，而機(jī)械屏障是維持腸上皮的選擇通透性及屏障功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，主要是上皮細(xì)胞頂端的TJ發(fā)揮作用[12]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)腸道微環(huán)境與CKD相關(guān)，但具體機(jī)制不明。本研究將從保護(hù)腸道機(jī)械屏障角度出發(fā)，進(jìn)一步探討黃芪三七合劑治療CKD的可能作用機(jī)制。

黃芪三七合劑為本課題組臨床上長(zhǎng)期用于治療CKD患者的復(fù)方制劑[8]，以含益氣補(bǔ)腎、健脾活血的黃芪、當(dāng)歸為君藥，以三七粉、昆布、大黃、牡蠣為臣藥，有丹參、川穹為佐藥，加上牛膝為使藥，引血下行，引藥入腎，此方“簡(jiǎn)、便、廉、驗(yàn)”。研究結(jié)果顯示，黃芪三七合劑和尿毒清顆粒不僅具有降低CKD大鼠SCr、BUN的作用，還可以減輕腎組織α-SMA、TGF-β1蛋白的表達(dá)，其中尤以黃芪三七合劑的改善作用更為顯著，表明黃芪三七合劑可以恢復(fù)受損的CKD大鼠腎功能并防治腎纖維化。

中醫(yī)治療注重全身陰陽(yáng)平衡及臟腑功能協(xié)調(diào)，提高機(jī)體免疫力，改善體質(zhì)，以扶正祛邪。慢性腎病可以引起腸道黏膜處于炎癥狀態(tài)，導(dǎo)致緊密連接蛋白表達(dá)降低，腸道機(jī)械屏障結(jié)構(gòu)功能紊亂，使腸道內(nèi)菌群失調(diào)和酸堿失衡，最后加速慢性腎病的進(jìn)展[1-2, 13]。那么，通過(guò)減輕腸道炎癥狀態(tài)，糾正機(jī)械屏障緊密連接的結(jié)構(gòu)紊亂，是否可以達(dá)到治療CKD大鼠的效果？我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芪三七合劑確實(shí)可以降低結(jié)腸炎癥因子IFN-γ和IL-6的表達(dá)，升高CKD大鼠結(jié)腸緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達(dá)，提示黃芪三七合劑治療CKD的作用可能與其改善腸道屏障結(jié)構(gòu)紊亂相關(guān)。模型組緊密連接蛋白的改變以ZO-1和Occludin為主，其中又以ZO-1蛋白的變化最明顯，可能是由于ZO-1蛋白在緊密連接中扮演錨的角色供膜蛋白附著，起著關(guān)鍵性作用[14-15]。該結(jié)果符合大多數(shù)研究結(jié)果[12, 16-17]。

Kaori Morimoto等[18-19]研究表示，CKD患者腸道會(huì)代償性參與多種尿毒癥毒素的代謝，如硫酸吲哚酯、有機(jī)陰離子和尿酸，同時(shí)也會(huì)造成腸道失代償，加重CKD的進(jìn)展。有研究顯示這可能與腸道微生物有關(guān)[20]。而CKD可導(dǎo)致患者腸道處于微炎癥狀態(tài)和機(jī)械屏障功能障礙，進(jìn)而引起腸道菌群紊亂，而腸道菌群產(chǎn)生的短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸和丁酸)可以改善受損腎功能，具體機(jī)制可能與短鏈脂肪酸調(diào)節(jié)表觀遺傳有關(guān)[19, 21]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)黃芪三七合劑改善腸道微炎癥狀態(tài)和機(jī)械屏障功能障礙可能緩解尿毒癥毒素對(duì)腸道的損害和逆轉(zhuǎn)腸道菌群紊亂，進(jìn)而有效排出尿毒癥毒素和產(chǎn)生對(duì)腎有保護(hù)作用的短鏈脂肪酸，可能為黃芪三七合劑改善受損腎功能的重要機(jī)制之一，也是下步我們重點(diǎn)研究探討的方向。

此外，在本實(shí)驗(yàn)中建立的CKD 動(dòng)物模型，是參照Shinozaki等[9]創(chuàng)建的方法，通過(guò)右腎切除左腎缺血再灌注建立CKD模型，不同于常規(guī)CKD造模方法，該模型能很好模擬CKD發(fā)病過(guò)程，更貼近由急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)導(dǎo)致的CKD疾病。在設(shè)置黃芪三七合劑劑量分組時(shí)，預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示，低濃度便能明顯改善CKD大鼠腎功能下降和腎纖維化，所以設(shè)置低劑量組和高劑量組足以說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果,文中表1、表3可以看出高低劑量組存在差異，說(shuō)明在改善TJ體系蛋白因子是有差異。

綜上所述，黃芪三七合劑可有效改善慢性腎病大鼠腎功能，減輕腎纖維化，其作用可能與糾正結(jié)腸機(jī)械屏障結(jié)構(gòu)紊亂、減少炎癥因子表達(dá)有關(guān)。