竇全偉 李吉濤, 劉 萍, 李 健, 劉九美 孫東方 蔡 影 環(huán)朋朋

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 青島 266071;2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室, 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室, 青島 266235)

脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)是分布于中國(guó)大陸沿岸、朝鮮半島西岸的淺海低鹽水域的一種熱溫帶海區(qū)中小型底棲蝦類, 以黃、渤海產(chǎn)量最高, 是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)蝦類之一[1]。脊尾白蝦具有廣溫性[2]、廣鹽性[3]、繁殖率高[4,5]等特點(diǎn), 具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值, 是新興的養(yǎng)殖蝦類, 已成為沿海灘涂地區(qū)的主要特色水產(chǎn)養(yǎng)殖品種。

由細(xì)菌及病毒等微生物引起的疾病對(duì)蝦類養(yǎng)殖造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[6], 因此對(duì)蝦類非特異性免疫防御機(jī)制的研究正在廣泛開(kāi)展。研究表明, 血藍(lán)蛋白不但具有載氧功能, 還有儲(chǔ)存能量、維持滲透壓、調(diào)節(jié)蛻皮及固化表皮的功能[7]。此外, 大量研究證明甲殼動(dòng)物血藍(lán)蛋白也是免疫防御體系中的重要免疫因子, 血藍(lán)蛋白及其降解片段還具有凝集活性、抗菌抗病毒活性、酚氧化物酶活性、抗腫瘤活性等多種免疫學(xué)功能, 被認(rèn)為是一種具有重要免疫活性的多功能蛋白[8—11]。目前, 隨著對(duì)甲殼動(dòng)物血藍(lán)蛋白功能的深入研究, 其基因cDNA序列已相繼被克隆[12—14]。研究表明, 凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)有2個(gè)血藍(lán)蛋白亞基, 且哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)感染后其mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)[15]。Tassanakajon等[16]研究發(fā)現(xiàn)斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)血藍(lán)蛋白五種不同亞型在序列及長(zhǎng)度上存在差別, 且具有抗菌活性。郭玲玲等[17]以凡納濱對(duì)蝦為研究對(duì)象, 通過(guò)生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白大亞基中存在HcLV1、HcLV2、HcLV3等多種變體, 并采用RACE (Rapid-amplification of cDNA ends)技術(shù)獲得HcLV1、HcLV3的cDNA全長(zhǎng), 通過(guò)副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus)、乙型鏈球菌(Streptococcus)及溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)等不同病原菌刺激對(duì)蝦后, 血藍(lán)蛋白大亞基變體對(duì)不同病原刺激發(fā)生明顯的響應(yīng),且不同病原刺激后可致使不同變體協(xié)同作用。Xu等[18]研究發(fā)現(xiàn)凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白大亞基至少存在四種變體且均具有抗病毒活性, 提示血藍(lán)蛋白具有分子多樣性, 且在對(duì)蝦抗病免疫防御中有重要作用。我們已經(jīng)獲得了脊尾白蝦血藍(lán)蛋白大亞基基因[19],并對(duì)其免疫功能進(jìn)行了初步研究, 但其變體及其功能的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的脊尾白蝦轉(zhuǎn)錄組文庫(kù), 篩選獲得了2個(gè)血藍(lán)蛋白變體序列, 采用RACE技術(shù)克隆了脊尾白蝦血藍(lán)蛋白大亞基變體基因的cDNA全長(zhǎng), 并分析了變體基因在金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌及白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV)感染后基因的相對(duì)表達(dá)變化, 對(duì)豐富脊尾白蝦血藍(lán)蛋白的分子多態(tài)性與功能多樣性具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

取體長(zhǎng)(4.5±0.25) cm、體重(2.19±0.42) g的健康脊尾白蝦暫養(yǎng)3d, 設(shè)置金黃色葡萄球菌感染組、副溶血弧菌感染組、WSSV感染組和對(duì)照組, 每組100尾, 設(shè)置3個(gè)平行, 分別進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)。

1.2 菌懸液及WSSV粗提液的制備

配制LB肉湯和2216E(液體成分: 蛋白胨母膏,磷酸高鐵; 固體成分加瓊脂粉)液體及固體培養(yǎng)基,滅菌備用。將金黃色葡萄球菌(Stphylococcus aureus)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)菌種分別接種于LB肉湯和2216E固體培養(yǎng)基中, 分別在37℃和28℃培養(yǎng)過(guò)夜。選取單菌落接種于液體培養(yǎng)基中, 200 r/min搖床上培養(yǎng)8—10h, 最后將菌懸液離心, 棄上清液, 用生理鹽水對(duì)菌體進(jìn)行反復(fù)洗滌, 重懸后, 使菌體的濃度達(dá)108CFU/mL。

取感染W(wǎng)SSV的脊尾白蝦病蝦(本實(shí)驗(yàn)室保存)頭尖組織5 g, 加入800 μL 4℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(1×PBS), 4℃ 20000 r/min離心15min, 將獲得的勻漿液于4℃ 3000 r/min離心15min, 取上清液反復(fù)離心3次(4000 r/min 15min、6000 r/min 15min、8000 r/min 15min), 將所得的上清液用0.45 μm濾膜過(guò)濾除菌,將除菌的粗提液稀釋100倍(3.7×107copy/mL)進(jìn)行分裝并保存于-80℃冰箱中備用。

實(shí)驗(yàn)時(shí)將菌懸液、WSSV粗提液用微量注射器從脊尾白蝦的第2腹節(jié)處注入(20 μL/尾)。對(duì)照組注射等量1×PBS緩沖液。在注射后的6h、12h、24h、48h和72h取樣, 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取5尾蝦, 取血液、肝胰腺、鰓、肌肉等組織, 用于總RNA提取。

1.3 脊尾白蝦總RNA提取及cDNA合成

使用TransZol Up Plus RNA Kit (北京全式金生物技術(shù)有限公司)提取脊尾白蝦組織總RNA, 用核酸定量?jī)x(Thermo, NanoDrop 2000)和1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量及完整性。

cDNA合成體系(20 μL): 10 μL總RNA, 2 μL Oligo dT (50 μmol/L), 72℃水浴5min, 冰浴2min; 之后再向管中加入1.0 μL dNTP Mixture (each 10 mmol/L)、5×M-MLV Buffer 4.0 μL、0.5 μL RNase Inhibitor(40 μL/mL, TaKaRa)和1.0 μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa), 用DEPC水補(bǔ)足體積。42℃孵育lh; 72℃孵育15min; 4℃孵育20min。合成的cDNA用于后期脊尾白蝦血藍(lán)蛋白基因的克隆及Real-time PCR檢測(cè)。脊尾白蝦3′和5′RACE模板的合成根據(jù)SMARTTMRACE Amplification Kit9 (TaKaRa)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 脊尾白蝦血藍(lán)蛋白大亞基變體基因cDNA中間片段克隆

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室脊尾白蝦轉(zhuǎn)錄組庫(kù)中獲得的脊尾白蝦血藍(lán)蛋白大亞基變體基因EcHcL1和2序列設(shè)計(jì)引物HcL1-F/HcL1-R、HcL2-F/HcL2-R (上海生工生物工程有限公司合成)(表 1)。PCR反應(yīng)體系(10 μL): 正反引物各0.4 μL, LA Mix 5 μL, cDNA模板0.2 μL, ddH2O 4 μL。根據(jù)引物退火溫度設(shè)定反應(yīng)程序。

表 1 本研究所用引物序列Tab. 1 Sequences of the primers used in this study

1.5 脊尾白蝦血藍(lán)蛋白大亞基變體基因cDNA 5′和3′末端的擴(kuò)增

根據(jù)測(cè)序得到的中間片段序列設(shè)計(jì)5′ RACE引物(5HcL1和5HcL2)以及3′ RACE引物(3HcL1和3HcL2)(表 1)擴(kuò)增脊尾白蝦大亞基血藍(lán)蛋白大亞基變體基因cDNA全長(zhǎng)序列。按照SMARTTMcDNA Amplification Kit (Clontech)說(shuō)明書(shū)推薦的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行5′ RACE和3′ RACE擴(kuò)增。

1.6 序列分析

將測(cè)序結(jié)果去載體后, 采用ContigExpress Application進(jìn)行5′和3′端序列拼接, 用NCBI BLAST(http://blast.ncbi.nlm.gov/Blast.cgi)和SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行序列比對(duì)及結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè), 應(yīng)用SignalP 4.0軟件分析信號(hào)肽, 通過(guò)DNAMAN軟件進(jìn)行血藍(lán)蛋白的氨基酸序列多序列比對(duì),用MEGA 6.0軟件[20]中的Neighbor-joining法[21]構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)。

1.7 脊尾白蝦血藍(lán)蛋白大亞基變體基因組織分布特征分析

根據(jù)脊尾白蝦血藍(lán)蛋白大亞基變體基因EcH-cL1和2基因設(shè)計(jì)正反向引物(QHcL1-F/QHcL1-R、QHcL2-F/QHcL2-R)(表 1), 用于Real-time PCR檢測(cè)EcHcL1、2基因的組織分布情況。使用SYBR Premix ExTaqⅡ試劑(TaKaRa), Applied Biosystems 7500 Real Time PCR儀上進(jìn)行, 反應(yīng)體系為10 μL:5 μL SYBR Premix ExTaqⅡ、1 μL cDNA、0.4 μL正反向引物、0.2 μL ROX Reference dye Ⅱ及3 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 10min; 95℃ 30s, 95℃ 5s,60℃ 34s, 40個(gè)循環(huán); 95℃ 15s; 60℃ 1min; 95℃15s。以β-actin基因作為內(nèi)參基因, 樣本和內(nèi)參均設(shè)置3個(gè)平行, 采用2-ΔΔCt方法[22]計(jì)算EcHcL1和2基因的相對(duì)表達(dá)量, 利用SPSS17.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析(One-way, ANOVA), 并對(duì)其顯著性進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.8 病原感染脊尾白蝦后血藍(lán)蛋白大亞基變體基因的表達(dá)分析

分別提取副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌及WSSV感染后不同時(shí)間脊尾白蝦的肝胰腺和血細(xì)胞組織的RNA, 按照前述方法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA進(jìn)行Real-time PCR, 以β-actin作為內(nèi)參, 樣本和內(nèi)參均設(shè)置3個(gè)平行, 檢測(cè)細(xì)菌感染下的脊尾白蝦血細(xì)胞和肝胰腺中EcHcL1和2基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況。反應(yīng)體系、反應(yīng)程序及數(shù)據(jù)處理同如1.6所述。

2 結(jié)果

2.1 脊尾白蝦血藍(lán)蛋白大亞基變體基因EcHcL1和2全長(zhǎng)cDNA序列的克隆與分析

采用RACE方法和RT-PCR擴(kuò)增獲得脊尾白蝦血藍(lán)蛋白大亞基變體基因EcHcL1和2 cDNA全長(zhǎng)(GenBank登錄號(hào): MH069500和MH 069501)。EcH-cL1序列全長(zhǎng)2248 bp, 包括2058 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)、66 bp的5′ UTP和137 bp的3′ UTR; 編碼685個(gè)氨基酸, 前21個(gè)氨基酸組成信號(hào)肽; 預(yù)測(cè)分子量為79.8 kD 。EcHcL2序列全長(zhǎng)2121 bp (ORF:2031 bp), 10 bp的5′ UTP和80 bp的3′ UTR; 編碼676個(gè)氨基酸, 前27個(gè)氨基酸組成信號(hào)肽; 預(yù)測(cè)分子量為78.3 kD, 理論等電點(diǎn)PI為5.56 。SMART軟件分析表明, EcHcL1-2-3均含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域: Hemocyanin_N、Hemocyanin_M、Hemocyanin_C, 只是EcHcL1多了一個(gè)酪氨酸酶結(jié)構(gòu)域(圖 1)。Hemoeyanin-M結(jié)構(gòu)域中的2個(gè)銅離子結(jié)合位點(diǎn)含6個(gè)保守的組氨酸殘基。三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件(https://swiss-model.expasy.org/)顯示EcHcL1-2三維結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了差異(圖 2): 在529—650 aa,EcHcL1以β-折疊為主,EcHcL2以無(wú)規(guī)則卷曲為主。

圖 1 脊尾白蝦EcHcL1和2血藍(lán)蛋白結(jié)構(gòu)域位置Fig. 1 The locations of three domains in EcHcL1 and 2 hemocyanin A. EcHcL1; B. EcHcL2

圖 2 脊尾白蝦EcHcL1和2血藍(lán)蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 2 Three-dimensional structure of EcHcL1 and 2 A. EcHcL1; B. EcHcL2

2.2 脊尾白蝦血藍(lán)蛋白EcHcL1和2基因同源性分析

使用NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對(duì)脊尾白蝦EcHcL1和2基因編碼的氨基酸序列與其他物種的血藍(lán)蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源性比較, EcHcL1和2在氨基酸序列上與日本沼蝦同源性最高達(dá)到84.08%, 與凡納濱對(duì)蝦、日本對(duì)蝦(Marsupenaeus japonicus)以及斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)血藍(lán)蛋白序列同源性分別為77.54%、76.66%和76.39%。

利用MEGA 6.0軟件對(duì)脊尾白蝦EcHcL1和2基因氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析, 并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖 3)。結(jié)果顯示在15個(gè)物種中, 脊尾白蝦EcH-cL1和2與脊尾白蝦EcHcL以及日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)為一支并與中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)、日本對(duì)蝦、凡納濱對(duì)蝦、斑節(jié)對(duì)蝦等動(dòng)物的血藍(lán)蛋白為一個(gè)亞群; 與紅鰲鰲蝦(Cherax quadricarinatus)、珍寶蟹(Metacarcinus magister)、中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)、藍(lán)蟹(Callinectes sapidus)、擬穴青蟹(Scylla paramamosain)為另一個(gè)亞群。EcHcL1和2在進(jìn)化上與日本沼蝦的親緣關(guān)系最近, 與克氏原鰲蝦(Procambarus clarkii)、鯨虱(Cyamus scammoni)、斑點(diǎn)海虱(Eurydice pulchra)、蛀木水虱(Limnoria quadripunctata)等動(dòng)物的血藍(lán)蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 脊尾白蝦血藍(lán)蛋白EcHcL1和2基因組織表達(dá)分析

圖 3 利用MEGA 4.0構(gòu)建的基于EcHcL1和2基因氨基酸序列的NJ系統(tǒng)樹(shù)Fig. 3 NJ tree about EcHcL1-2 amino acid sequences using MEGA 4.0

為了分析EcHcL1和2的組織表達(dá)特異性, 分別設(shè)計(jì)2種變體的特異性引物。以β-actin作為內(nèi)參對(duì)照, 利用Real-time PCR檢測(cè)脊尾白蝦EcHcL1和2在血細(xì)胞、肝胰腺、腸、腹神經(jīng)節(jié)、心臟、卵巢、眼柄、胃、鰓和肌肉組織中的表達(dá)量。結(jié)果如圖 4顯示,EcHcL1和2在脊尾白蝦的10種組織中均有表達(dá)。EcHcL1在血細(xì)胞中表達(dá)最高, 肝胰腺次之, 而在肌肉中的表達(dá)量最低;EcHcL2在肝胰腺中表達(dá)最高, 而在肌肉和胃中的表達(dá)量最低。

圖 4 EcHcL1和2在脊尾白蝦不同組織里的相對(duì)表達(dá)量Fig. 4 The relative expression of EcHcL1 and 2 in different tissues in E. carinicauda

2.4 脊尾白蝦血藍(lán)蛋白EcHcL1和2基因在肝胰腺中的表達(dá)

如圖 5、圖 6所示, 脊尾白蝦感染金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、WSSV后, 脊尾白蝦肝胰腺中EcHcL1和2基因表現(xiàn)出一定的時(shí)間依賴性, 總體趨勢(shì)表現(xiàn)為先升高后降低。EcHcL1表達(dá)量在金黃色葡萄球菌和WSSV感染后均在12h達(dá)到峰值, 與對(duì)照組有極顯著差異(P＜0.01), 到72h下降到與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P＞0.05);EcHcL1表達(dá)量在副溶血弧菌感染后在24h達(dá)到峰值, 與對(duì)照組差異極顯著(P＜0.01),24h后表達(dá)量持續(xù)下降,到72h下降到與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。EcHcL2表達(dá)量在金黃色葡萄球菌感染后趨勢(shì)不明顯, 在48h達(dá)到峰值,與對(duì)照組有顯著性差異(P＜0.05), 到72h下降到與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P＞0.05); 在副溶血弧菌和WSSV感染后均在24h達(dá)到峰值, 與對(duì)照組差異極顯著(P＜0.01), 24h后表達(dá)量持續(xù)下降, 到72h下降到與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

2.5 脊尾白蝦血藍(lán)蛋白EcHcL1和2基因在血細(xì)胞中的表達(dá)分析

圖 5 EcHcL1基因在脊尾白蝦肝胰腺組織中的表達(dá)變化Fig. 5 Expression level of EcHcL1 in hepatopancreas of E. carinicauda

圖 6 EcHcL2基因在脊尾白蝦肝胰腺組織中的表達(dá)變化Fig. 6 Expression level of EcHcL2 in hepatopancreas of E. carinicauda

圖 7 EcHcL1基因在脊尾白蝦血細(xì)胞中的表達(dá)變化Fig. 7 Expression level of EcHcL1 in haemocytes of E. carinicauda

圖 8 EcHcL2基因在脊尾白蝦血細(xì)胞中的表達(dá)變化Fig. 8 Expression level of EcHcL2 in haemocytes of E. carinicauda

如圖 7、圖 8所示, 脊尾白蝦感染金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、WSSV后, 脊尾白蝦血細(xì)胞中EcHcL1和2基因表現(xiàn)出一定的時(shí)間依賴性, 總體趨勢(shì)表現(xiàn)為先升高后降低。EcHcL1表達(dá)量在金黃色葡萄球菌感染后均在12h達(dá)到峰值且與對(duì)照組差異顯著(P＜0.05), 到72h下降到與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P＞0.05); 在副溶血弧菌和WSSV感染后均在48h達(dá)到峰值, 與對(duì)照組差異極顯著(P＜0.01), 到72h下降到與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。EcHcL2表達(dá)量在金黃色葡萄球菌感染后趨勢(shì)不明顯; 在副溶血弧菌和WSSV感染后均在24h達(dá)到峰值, 且WSSV感染后表達(dá)量上升趨勢(shì)明顯大于副溶血弧菌感染后的表達(dá)量。

3 討論

血藍(lán)蛋白是甲殼動(dòng)物血淋巴中的含銅呼吸蛋白, 它的基本生物學(xué)功能是載氧, 另外它還具有多種免疫活性, 例如酚氧化酶活性、抗病毒活性、凝集活性和抗菌活性等多種免疫功能[23—25]。為了深入研究脊尾白蝦大亞基的分子特征, 我們采用RACE和生物信息學(xué)技術(shù), 對(duì)脊尾白蝦血藍(lán)蛋白大亞基2種變體(EcHcL1和2)進(jìn)行全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增和序列分析。我們發(fā)現(xiàn)EcHcL1和2與脊尾白蝦血藍(lán)蛋白大亞基EcHcL相似, 其分別編碼680個(gè)左右的氨基酸。兩者均具有血藍(lán)蛋白的典型結(jié)構(gòu)域, 包括銅離子結(jié)合區(qū), 6個(gè)組氨酸位點(diǎn)和Ig-like區(qū)等, 其中EcHcL1多了一個(gè)酪氨酸酶結(jié)構(gòu)域, 推測(cè)可能與色素代謝及酚氧化酶活性有關(guān)[23]。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示EcHcL與日本沼蝦血藍(lán)蛋白親緣關(guān)系最近,疣酋婦蟹、中華絨螯蟹、斑點(diǎn)海虱等甲殼動(dòng)物的血藍(lán)蛋白親緣關(guān)系次之。這說(shuō)明脊尾白蝦血藍(lán)蛋白大亞基變體與大亞基具有相似的分子特征, 提示其變體可能與血藍(lán)蛋白大亞基一樣具有多種免疫學(xué)功能。組織表達(dá)分布結(jié)果顯示EcHcL1和2在10種組織中均有表達(dá), 且均在肝胰腺和血細(xì)胞中表達(dá)較高, 與凡納濱對(duì)蝦[26]的研究結(jié)果一致, 說(shuō)明2種變體組織表達(dá)分布廣泛且在均在與免疫發(fā)生的組織或器官中表達(dá)量較高, 推測(cè)2種變體可能在免疫應(yīng)答中發(fā)揮了重要作用。

研究表明圓尾鱟(Carcinoscorpius rotundicauda)凝集素CL5可產(chǎn)生不同的亞型來(lái)識(shí)別細(xì)菌和真菌: 與細(xì)菌(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌)相結(jié)合的CL5的電泳圖譜大致相似, 而與真菌相結(jié)合的CL5的電泳圖譜與細(xì)菌圖譜比較出現(xiàn)較大的差異[27]。Destoumieux等[28]研究指出, 斑節(jié)對(duì)蝦可產(chǎn)生5種不同的抗菌肽, 其中抗菌肽3不僅具有抗真菌活性, 還可以抑制大腸桿菌E. coli363和細(xì)菌滕黃微球菌(Micrococcus luteus)的生長(zhǎng)。Woramongkolchai等[29]研究表明了斑節(jié)對(duì)蝦感染W(wǎng)SSV后抗菌肽5的mRNA水平在24h后明顯上調(diào), 提示其可能具有抗病毒活性。

由上可知, 存在于甲殼動(dòng)物中的多態(tài)性免疫分子, 其不同變體可能具有不同的免疫活性。由此推測(cè)脊尾白蝦血藍(lán)蛋白大亞基的不同變體也可能具有不同的免疫學(xué)功能。為此, 我們對(duì)脊尾白蝦進(jìn)行了病原脅迫實(shí)驗(yàn), 進(jìn)一步運(yùn)用Real-time PCR策略對(duì)2種變體的mRNA表達(dá)情況進(jìn)行了探討。結(jié)果由圖 5—8可知, 在3種病原菌脅迫下,EcHcL1在肝胰腺中表達(dá)量趨勢(shì)為先上升達(dá)到峰值后下降到與對(duì)照組無(wú)顯著性差異。EcHcL2表達(dá)量趨勢(shì)為先上升再下降再上升達(dá)到峰值, 最后72h下降到正常水平。與Yang等[30]報(bào)道的鰻弧菌感染中國(guó)明對(duì)蝦后不同時(shí)間點(diǎn)FcToll的表達(dá)變化情況相同。這樣的表達(dá)變化模式可能是在病原脅迫的初期, 機(jī)體對(duì)于外界刺激, 做出最初的應(yīng)激反應(yīng), 出現(xiàn)較弱的表達(dá)上升(如6h的表達(dá)上升), 此種變化在12h恢復(fù)至原始水平, 但是, 最初較弱的表達(dá)上升, 不足以抵御病原的刺激, 在24h出現(xiàn)第二次表達(dá)上調(diào), 來(lái)加強(qiáng)對(duì)病原菌的免疫防御。當(dāng)脊尾白蝦受到金黃色葡萄球菌脅迫后, 在肝胰腺和血細(xì)胞中EcHcL1均在12h出現(xiàn)表達(dá)量最高的情況(約為對(duì)照組的2—3倍), 說(shuō)明相對(duì)其他兩種菌, EcHcL1對(duì)球菌做出較早的免疫反應(yīng)(副溶血弧菌脅迫后,EcHcL1在肝胰腺和血細(xì)胞中分別在24h和48h達(dá)到峰值; 在WSSV感染后,EcH-cL1在肝胰腺和血細(xì)胞中分別在12h和48h達(dá)到峰值)。當(dāng)副溶血弧菌脅迫和WSSV后, 在肝胰腺和血細(xì)胞中EcHcL2均在24h出現(xiàn)峰值(約為對(duì)照組的2—9倍), 相對(duì)于球菌,EcHcL2對(duì)弧菌和WSSV做出更明顯的免疫反應(yīng)(球菌脅迫后,EcHcL2在肝胰腺中48h達(dá)到峰值, 在血細(xì)胞中表達(dá)量沒(méi)有明顯上調(diào)趨勢(shì))。綜上表明脊尾白蝦血藍(lán)蛋白大亞基變體與血藍(lán)蛋白大亞基一樣, 其mRNA表達(dá)變化與病原脅迫密切相關(guān), 可能具有抗菌抗病活性, 且不同變體對(duì)不同病原的響應(yīng)程度存在差異性, 提示可能不同的血藍(lán)蛋白變體在對(duì)蝦免疫防御中具有不同的最佳免疫學(xué)功能。

綜上, 血藍(lán)蛋白大亞基不同變體序列共同組成脊尾白蝦特有血藍(lán)蛋白超家族, 且這些變體具有相應(yīng)的最佳免疫防御功能, 共同參與脊尾白蝦的免疫防御, 對(duì)豐富脊尾白蝦血藍(lán)蛋白的分子多態(tài)性與功能多樣性具有重要的意義。