曹維嘉 邵子瑋 段孟洮 高玲玲 張有成 徐小東

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院普通外科，蘭州 730000)

中性粒細(xì)胞作為人體免疫系統(tǒng)的重要防線，在機(jī)體免疫應(yīng)答時(shí)發(fā)揮著極為關(guān)鍵的作用。機(jī)體受到病原體入侵時(shí)，中性粒細(xì)胞迅速聚集在損傷組織，通過(guò)吞噬和脫顆粒作用殺滅侵入的病原微生物。2004年Brinkmann等[1]首次發(fā)現(xiàn)，活化的中性粒細(xì)胞還可以通過(guò)釋放中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(Neutrophil extracellular traps,NETs)來(lái)參與捕獲并殺滅病原菌。NETs組成成分復(fù)雜，多種參與炎癥反應(yīng)的蛋白附著于其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[1-4]。近年來(lái)多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)NETs的產(chǎn)生與多種炎性疾病的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)。本文主要介紹了NETs的主要成分、作用、形成方式、檢測(cè)指標(biāo)以及其在相關(guān)炎性疾病中的研究進(jìn)展。

1 NETs的主要成分及作用

NETs是活化的中性粒細(xì)通過(guò)不同的方式向細(xì)胞外釋放的高濃度網(wǎng)狀DNA復(fù)合物，除了去聚化的染色質(zhì)DNA外，其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上主要黏附著瓜氨酸化組蛋白(CitH3)、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)、髄過(guò)氧化物酶(MPO)、長(zhǎng)正五聚蛋白(PTX-3)、抗菌肽LL-37等30多種蛋白和酶。研究發(fā)現(xiàn)脫氧核糖核酸酶(DNase)能夠直接破壞染色質(zhì)DNA迅速降解NETs，證明去聚化的胞外染色質(zhì)DNA是NETs最為重要的成分[1]。

研究表明，NETs除了殺滅病原菌外，還可以導(dǎo)致組織損傷并參與多種疾病的發(fā)展。NETs的這些生理作用與其組成成分密切相關(guān)。具有細(xì)胞毒性的細(xì)胞外組蛋白作為NETs的主要成分，能夠破壞內(nèi)皮細(xì)胞、水解蛋白質(zhì)參與組織損傷。精氨酸脫亞氨酶4(PAD4)介導(dǎo)組蛋白的瓜氨酸化更是NETs形成的關(guān)鍵步驟[2]。NE和PR3等絲氨酸蛋白酶通過(guò)切割毒力因子或裂解惰性前體蛋白抑制微生物的生長(zhǎng)。有研究發(fā)現(xiàn)NE還可以抑制組織因子(TFPI)，促進(jìn)血管內(nèi)纖維蛋白屏障的生成[3-5]。具有氧化活性的MPO不僅可以與活性氧(ROS)相互作用刺激NETs生成，同時(shí)還可以通過(guò)產(chǎn)生次氯酸殺滅病原菌。最近，有研究人員發(fā)現(xiàn)NETs上的P因子和補(bǔ)體C3可以將其捕獲的病原微生物呈遞給其他具有殺菌作用的細(xì)胞，從而共同限制機(jī)體炎癥發(fā)展[6]。當(dāng)體內(nèi)NETs生成過(guò)量時(shí)，長(zhǎng)正五聚蛋白(PTX-3)能夠減輕組蛋白導(dǎo)致的損傷，調(diào)控體內(nèi)NETs含量[7]。鑲嵌于NETs的分泌性蛋白酶抑制因子(SLPI)亦能夠調(diào)節(jié)NETs介導(dǎo)的組織損傷。此外，有研究發(fā)現(xiàn)SLPI作用于樹(shù)突狀細(xì)胞而誘導(dǎo)產(chǎn)生的Ⅰ型干擾素(IFN1)參與了系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和牛皮癬等疾病的發(fā)病[5]。

2 NETs的形成方式

中性粒細(xì)胞形成NETs的方式被命名為 NETosis。研究證實(shí)，不同的刺激物作用于中性粒細(xì)胞后NETs的形成方式有所不同。

(1)研究發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞受到佛波酯(PMA)或IL-8等物質(zhì)刺激后，在NADPH酶生成的活性氧(ROS)和鈣離子作用下，PAD4介導(dǎo)組蛋白瓜氨酸化導(dǎo)致染色質(zhì)的去聚化[8]。同時(shí)，ROS作為第二信使作用于MPO協(xié)同NE和LL-37易位至細(xì)胞核，導(dǎo)致核解聚和核膜破裂。隨后胞質(zhì)中具有殺滅病原微生物功能的各級(jí)顆粒和核染色質(zhì)的融合物被排出到細(xì)胞外構(gòu)成NETs的基本結(jié)構(gòu)，這一過(guò)程長(zhǎng)達(dá)1～4 h[9]。區(qū)別于既往的壞死和凋亡，NETs的形成伴隨著中性粒細(xì)胞死亡的方式被稱為Suicidal NETOsis。Raf-MEK-ERK通路和ROS的激活在其形成過(guò)程中扮演了關(guān)鍵角色[10]。

(2)Yipp等[11]在2012年通過(guò)活體顯影可視技術(shù)發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄菌在急性感染期能夠更為迅速(5～60 min)地刺激NETs產(chǎn)生。不同于Suicidal NETosis，中性粒細(xì)胞細(xì)胞膜上的TOLL樣受體或C3補(bǔ)體被金葡菌或TRL-4活化血小板等物質(zhì)識(shí)別后，核DNA隨即以出芽的方式被包裹成囊泡釋放。同時(shí)，不同的胞質(zhì)顆粒則聚集在囊泡周圍被一同排出胞外，此時(shí)胞內(nèi)核膜保持完整，活化的中性粒細(xì)胞并不死亡且仍然保持著吞噬和趨化作用。NETs的這種形成方式被命名為Vital NETosis，其形成過(guò)程不依賴于Raf-MEK-ERK通路和ROS[10,12]。最近有研究表明血小板中活化的糖蛋白作用于中性粒細(xì)胞上的CD18黏附分子后，可以分別通過(guò)激活ERK、PI3k和SRC酶刺激PMN發(fā)生vital NETosis[13]。

(3)Yousefi等[14]發(fā)現(xiàn)在脂多糖(LPS)和C5a刺激后，中性粒細(xì)胞內(nèi)的線粒體DNA在ROS作用下可以產(chǎn)生NETs，這一現(xiàn)象發(fā)生在更短的時(shí)間(15 min)內(nèi)。NETs的形成過(guò)程中同樣不伴隨中性粒細(xì)胞的死亡，其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

3 NETs的檢測(cè)指標(biāo)

由于結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，NETs尚無(wú)統(tǒng)一的檢測(cè)指標(biāo)和方法，目前主要通過(guò)檢測(cè)其特異成分的表達(dá)以確定存在。由中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的游離胞外DNA(Cell-free DNA)作為NETs的主要成分，經(jīng)常被用來(lái)檢測(cè)NETs的存在。該檢測(cè)方法的局限性在于不能與巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的少量Cell-free DNA進(jìn)行區(qū)別[15]。PAD4介導(dǎo)的citH3被認(rèn)為是NETs形成的標(biāo)志物，因此被廣泛運(yùn)用于檢測(cè)NETs的表達(dá)。需要注意的是，有報(bào)道稱部分NETs的形成可能并不依賴于PAD4[16]。最新的研究表明，citH3還可以作為部分腫瘤早期診斷和判定預(yù)后的潛在指標(biāo)[17]。在底物酶和不同抗體作用下標(biāo)記的DNA和胞外蛋白DNA-NE、DNA-MPO共定位復(fù)合物由于具有高度特異性，因而在NETs的檢測(cè)中最具有代表性[15]。

4 NETs與炎性疾病

4.1NETs與痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎 痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎是一種由過(guò)度飽和的針狀尿酸鹽結(jié)晶(MSU)沉積在關(guān)節(jié)引發(fā)的自限性急性炎癥，MSU晶體刺激中性粒細(xì)胞聚集和活化是引發(fā)痛風(fēng)急性發(fā)作的關(guān)鍵。MSU晶體與NETs的相互作用進(jìn)一步揭示了痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)理。研究證實(shí)痛風(fēng)患者滑膜液中充滿白介素IL-1β、IL-18、MSU晶體以及中性粒細(xì)胞[18]。Mitroulis等[19]在痛風(fēng)滑膜液中發(fā)現(xiàn)了染色的dsDNA和MPO等NETs組分?；ひ褐械腗SU晶體可以通過(guò)刺激中性粒細(xì)胞發(fā)生NETosis和炎癥反應(yīng)。同時(shí)，巨噬細(xì)胞NLPR3 炎性體分泌的IL-1β可以通過(guò)增強(qiáng)MSU晶體作用，刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生更多的NETs。過(guò)量的NETs與伴隨其釋放的有害顆粒蛋白可能共同加劇了炎癥癥狀[20]。最近有研究證實(shí)NETs參與了痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎的緩解。隨著NETs的大量積累，高濃度的NETs黏附形成特殊聚合網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)aggregated NETs(aggNETs)。Schauer等[21]研究表明aggNETs能迅速捕捉促炎因子和趨化因子，通過(guò)降解促炎介質(zhì)的水平和抑制中性粒細(xì)胞的聚集限制急性期炎癥加重。aggNETs上大量暴露的絲氨酸蛋白酶參與了這一過(guò)程。另外，急性炎癥末期白色的aggNETs還可以覆蓋在MSU結(jié)晶表面將其與炎癥介質(zhì)隔離，促使其形成成熟的痛風(fēng)石，從而完全停止對(duì)機(jī)體的急性損傷。

MUS誘導(dǎo)NETs生成的分子及其調(diào)節(jié)機(jī)制目前尚不完全清楚。NADPH氧化酶缺乏的大鼠中性粒細(xì)胞被MSU刺激后NETs和aggNETs不能形成，提示NADPH氧化酶參與了這一過(guò)程[21]。Desai等[22]通過(guò)RIPK1、RIPK3、MLKL的抑制劑分別阻止MUS刺激NETs生成后，ROS的產(chǎn)生并未受到影響，提示NETs的形成可能涉及ROS下游的RIPK1-RIPK3-MLKL信號(hào)凋亡途徑。最近，Arai等[23]發(fā)現(xiàn)可溶性尿酸獨(dú)立于NADPH氧化酶刺激生成了NETs，表明痛風(fēng)中NETs的生成機(jī)制可能是復(fù)雜多樣的。嘌呤P2Y6受體也被證實(shí)參與了痛風(fēng)發(fā)作時(shí)NETs的形成。Sil等[24]通過(guò)實(shí)時(shí)成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)，P2Y6特殊抑制劑MRS2578能夠減少PMN的聚集，阻止aggNETs的生成，其機(jī)制可能與抑制ROS和促炎因子IL-8釋放有關(guān)。最新的研究顯示，吞噬細(xì)胞可以通過(guò)吞噬微小的尿酸鹽聚合體SMA，阻止循環(huán)中MSU結(jié)晶及NETs的生成[25]。

4.2NETs與胰腺炎 胰腺炎是由多種病因引起胰酶大量分泌而導(dǎo)致的胰腺自身消化、水腫、出血及壞死的炎性疾病，目前尚無(wú)特效的治療手段。炎癥介質(zhì)和胰蛋白酶釋放發(fā)生紊亂被認(rèn)為是炎癥發(fā)生和加重的關(guān)鍵[26]。Merza等[27]的體內(nèi)體外研究表明，NETs參與了胰腺炎的病理生理過(guò)程。在建立的重癥急性胰腺炎(SAP)模型大鼠胰腺內(nèi)，研究人員通過(guò)免疫熒光技術(shù)觀察到了大量NETs的產(chǎn)生，而體內(nèi)循環(huán)中cfDNA濃度和CitH3的表達(dá)增加證實(shí)了NETs的產(chǎn)生。通過(guò)在模型大鼠體內(nèi)注射脫氧核糖核酸酶(DNase)預(yù)處理中性粒細(xì)胞降解NETs，減少了腺泡細(xì)胞以及胰腺組織的損傷。在此之前，高表達(dá)的組蛋白已經(jīng)被證實(shí)參與了胰腺炎時(shí)胰腺組織損傷[28]。隨著NETs的降解，DNase酶還降低了包括CXCL2、IL-6、HMGB1在內(nèi)的多種炎癥介質(zhì)和蛋白酶的濃度。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NETs還能夠直接作用腺泡細(xì)胞激活胰蛋白酶和STAT3信號(hào)通路，其機(jī)制可能與NETs產(chǎn)生時(shí)NADPH酶大量形成有關(guān)[27,28]。Moritz等[29]在IL-17基因過(guò)度表達(dá)誘發(fā)的胰腺炎小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了大量PAD4介導(dǎo)的CitH3和NE。PAD4基因敲除小鼠和野生型小鼠相比，PAD4基因缺乏小鼠基本不能被IL-17誘導(dǎo)發(fā)展為胰腺炎。這可能與PAD4基因缺乏導(dǎo)致的組蛋白不能瓜氨酸化相關(guān)。IL-17等炎癥因子誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞向胰腺胰管聚集，而導(dǎo)管中的堿性環(huán)境和大量的Ca離子是PAD4表達(dá)上調(diào)的重要條件。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，聚集在胰腺導(dǎo)管內(nèi)的嗜中性粒細(xì)胞受到胰液中的碳酸鹽的刺激后，通過(guò)釋放胞外染色質(zhì)纏繞的aggNETs亦可以阻礙胰液分泌激活胰蛋白酶。這些現(xiàn)象提示NETs可能參與了胰腺炎的發(fā)病機(jī)制。因此調(diào)控體內(nèi)NETs的生成可能成為治療胰腺炎的潛在手段。

4.3NETs與其他炎性疾病 ①2型糖尿病患者往往涉及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)增加和吞噬功能障礙等慢性炎癥的表現(xiàn)，高血糖患者體內(nèi)炎癥細(xì)胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激環(huán)境和炎癥因子有利于NETosis 的發(fā)生。研究證實(shí)糖尿病模型大鼠的中性粒細(xì)胞被PMA刺激后更容易出現(xiàn)NETs，其體內(nèi)PAD4的表達(dá)相較于正常組上升4倍[30]。此外，相較于健康人群，糖尿病患者體內(nèi)dsDNA和NE等NETs的內(nèi)容物含量明顯增加，其增加程度和糖化血紅素(HbA1c)以及IL-6濃度呈正相關(guān)[31]。②糖尿病視網(wǎng)膜疾病和視網(wǎng)膜靜脈阻塞等眼部疾病會(huì)導(dǎo)致視力下降甚至喪失，視網(wǎng)膜細(xì)胞分泌的炎癥因子IL-8和TNF-α被證實(shí)參與眼部炎癥發(fā)病環(huán)節(jié)[32]。研究人員在視網(wǎng)膜脫落患者的玻璃體中發(fā)現(xiàn)了CitH3。NETs的細(xì)胞毒性作用歸咎于組蛋白成分，其可以防止胞外DNA的降解和損傷微血管[33]。Barliya等[32]在向大鼠眼部注射白介素IL-8和TNF-α 24 h后，首次在大鼠眼部觀察到CitH3。而大鼠眼部注射DNAse 酶后，染色的CitH3發(fā)生降解，NETs隨即消失。隨后研究人員在增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變的患者眼部同樣發(fā)現(xiàn)了NE-MPO和CitH3-MPO等NETs的主要成分，由此證實(shí)NETs可能參與了眼部疾病的炎癥反應(yīng)[32]。

5 結(jié)語(yǔ)

自發(fā)現(xiàn)NETs的十余年來(lái)，有關(guān)NETs的研究成為炎性疾病研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究表明，NETs除了能消滅病原微生物外，還從多個(gè)方面參與并影響了炎性疾病的病理生理過(guò)程。雖然NETs在這些疾病中的具體作用機(jī)制及信號(hào)通路的研究尚處于起步階段，但已有的研究結(jié)果提示我們，對(duì)NETs在炎性疾病中的作用進(jìn)一步研究，完善NETs的相關(guān)調(diào)控機(jī)制，可能會(huì)為今后炎性疾病的治療方案和特異性靶點(diǎn)藥物的開(kāi)發(fā)提供新的發(fā)展思路。