張奎，李重陽，蘇晶晶，談娟，徐曼，崔紅娟

?

家蠶整合素2的表達、純化及其免疫功能

張奎，李重陽，蘇晶晶，談娟，徐曼，崔紅娟

（西南大學(xué)家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室，重慶 400716）

【目的】分析家蠶（）整合素2的序列和結(jié)構(gòu)特征及其在家蠶感染病原菌后血細胞中的表達變化，檢測其重組蛋白對不同病原相關(guān)模式分子識別和病原菌的凝聚作用，為進一步探究家蠶整合素2的蛋白功能打下基礎(chǔ)?！痉椒ā坷蒙镄畔W(xué)對整合素2的序列和結(jié)構(gòu)特征進行分析，利用實時熒光定量PCR檢測家蠶分別注射大腸桿菌（）和金黃色葡萄球菌（）后整合素2在血細胞中的表達變化。通過PCR技術(shù)擴增獲得整合素2完整的胞外域片段，構(gòu)建至pET22b原核表達載體后轉(zhuǎn)化至Rosetta(DE3)表達菌株。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得重組蛋白，利用Ni-NTA親和層析得到純化的體外重組蛋白，利用SDS-PAGE和western blot對純化獲得的體外重組蛋白的純度和質(zhì)量進行檢測。利用ELISA檢測重組蛋白與兩種不同病原相關(guān)分子模式LPS和PGN的結(jié)合情況，運用Western blot檢測重組蛋白與不同病原微生物的結(jié)合情況，通過凝集試驗檢測重組蛋白對金黃色葡萄球菌的凝集能力，最后在個體水平探索重組蛋白在體內(nèi)細菌清理中的作用?！窘Y(jié)果】家蠶整合素2具有典型的整合素亞基保守結(jié)構(gòu)特征，即由一個較長的胞外域、一個單次跨膜結(jié)構(gòu)域和一個較短的胞內(nèi)域構(gòu)成。家蠶整合素2具有金屬離子結(jié)合位點MIDAS、EGF結(jié)構(gòu)域、半胱氨酸重復(fù)基序和NPxY等整合素典型的結(jié)構(gòu)特征。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果表明家蠶在受到細菌感染后，整合素2的表達發(fā)生顯著變化。通過原核表達和蛋白純化獲得純度較高的重組蛋白，SDS-PAGE和Western blot檢測結(jié)果表明純化的重組蛋白純度較高，可以用于后續(xù)試驗。ELISA試驗表明重組蛋白對LPS和PGN等病原相關(guān)分子模式具有較強的結(jié)合能力。細菌結(jié)合試驗結(jié)果顯示重組蛋白能夠結(jié)合多種細菌，但與革蘭氏陽性菌的結(jié)合能力要高于革蘭氏陰性菌。細菌凝聚試驗結(jié)果顯示重組蛋白在Ca2+的存在下對金黃色葡萄球菌具有較強的凝聚作用。細菌清除試驗證實重組蛋白可以有效促進機體對外源入侵細菌的清理作用?！窘Y(jié)論】整合素2具有典型的整合素亞基的結(jié)構(gòu)特征，可能具有識別病原相關(guān)分子模式，如LPS和PGN等的能力，通過與細菌的直接結(jié)合而實現(xiàn)對入侵病原微生物的凝聚作用，從而增強有機體的免疫能力，推測在家蠶免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

家蠶；整合素2；細菌感染；原核表達；細菌凝聚

0 引言

【研究意義】整合素是一類以異源二聚體的形式介導(dǎo)細胞與細胞、細胞與細胞外基質(zhì)相互作用的跨膜糖蛋白，參與細胞內(nèi)外信號的雙向傳導(dǎo)作用[1]，由和兩個亞基組成異源二聚體[2]，廣泛存在于后生動物中[3]，在免疫[4]、黏附與遷移[5-6]、凋亡[7-8]、組織構(gòu)成與修復(fù)[9]以及腫瘤發(fā)生[10]等方面發(fā)揮重要作用。目前，已從家蠶（）中克隆鑒定得到6個和5個亞基[11]，筆者課題組前期研究工作顯示整合素PS3特異表達于部分顆粒細胞，可能參與吞噬與包囊反應(yīng)[12]，而整合素3可能作為一種模式識別蛋白，特異性識別革蘭氏陽性菌的入侵[13]。孫亞蘭從家蠶中率先鑒定克隆得到整合素2，推測其可能參與血細胞包囊作用的調(diào)控[14]，但其功能仍有待解析。對家蠶整合素的功能研究有助于了解昆蟲免疫防御機制，同時對制定鱗翅目害蟲防治策略具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】整合素在果蠅中的研究較多，目前在果蠅基因組中已經(jīng)鑒定得到3個和2個亞基，在組織發(fā)育[15-17]、附著[18-19]、重塑[20]以及干細胞增殖與維持[21]等方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用。整合素廣泛存在于昆蟲中，在煙草天蛾（）、亞洲玉米螟（）、大豆夜蛾（）、埃及伊蚊（）和家蠶等多種昆蟲中均鑒定到整合素。大豆夜蛾存在多個和亞基，它們主要表達于血細胞，參與調(diào)控血細胞的黏附作用[22-23]。在岡比亞按蚊（）中，一個成員在抵御柏氏瘧原蟲入侵中發(fā)揮特殊作用[24]，另一個成員——BINT2，參與對大腸桿菌的吞噬作用[25]，而地中海果蠅（）的一個亞基也發(fā)現(xiàn)具有調(diào)控細菌吞噬的功能[26]。亞洲玉米螟1被證實能夠調(diào)控漿細胞的延展和包囊反應(yīng)[27-28]，而煙草天蛾1也參與調(diào)控血細胞對外源入侵物的包囊[29]。【本研究切入點】家蠶是一種重要的經(jīng)濟昆蟲和模式昆蟲。筆者課題組前期對家蠶整合素家族基因進行了系統(tǒng)性鑒定，對其表達情況進行了分析[11,30-31]，這些工作為家蠶整合素的研究打下了基礎(chǔ)。通過對家蠶整合素功能進行研究，揭示其在免疫反應(yīng)中發(fā)揮的作用，可為蠶病和鱗翅目病蟲害的防治提供理論支撐。【擬解決的關(guān)鍵問題】運用生物信息學(xué)方法對家蠶整合素2的結(jié)構(gòu)與序列特征進行分析，探索其在病原菌入侵中發(fā)揮的作用。通過原核表達和純化獲得高純度的重組蛋白，檢測重組蛋白與病原菌以及病原分子模式的結(jié)合情況，探索整合素2在家蠶病原菌入侵應(yīng)答中的作用。

1 材料與方法

試驗于2016年7月至2018年7月在家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室（西南大學(xué)）完成。

1.1 試驗材料

所用家蠶品系為大造，保存于筆者實驗室，于25—27℃條件下用干凈的新鮮桑葉飼養(yǎng)。所用感受態(tài)細胞和HiFi taq酶購自北京全式金公司，Trizol、PMD19-T和限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自promega公司，膠回收試劑盒購自Axygen公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自Qiagen公司，質(zhì)粒pET22b、大腸桿菌（）、綠膿桿菌（）、金黃色葡萄球菌（）、枯草芽孢桿菌（）保存于筆者實驗室。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，來自）購自Sigma公司，肽聚糖（peptidoglycan，PGN，來自）購自InvivoGen公司。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

Luria-Bertani（LB）固定培養(yǎng)基：NaCl 2 g，胰蛋白胨2 g，酵母提取物4 g，瓊脂粉3 g加雙蒸水200 mL，于121℃高壓滅菌20 min。待培養(yǎng)基冷卻至50—60℃時，加入抗生素，輕柔混合均勻后制備平板；LB液體培養(yǎng)基：NaCl 2 g，胰蛋白胨2 g，酵母提取物4 g加雙蒸水200 mL，于121℃高壓滅菌20 min，4℃保存?zhèn)溆茫籘BS緩沖液：Tris-HCl 1.21 g，NaCl 8.77 g加雙蒸水充分溶解后調(diào)節(jié)pH至7.5并定容至1 L。PBS緩沖液和異丙基硫代半乳糖苷Isopropyl-D- Thiogalactoside（IPTG）等試劑購自上海生工公司。

1.3 序列比對分析

家蠶整合素2和3的全長cDNA序列均在筆者實驗室前期工作中獲得[11]，煙草天蛾整合素1（Ms1，AAU11316.1）和草地貪夜蛾（）整合素1（Sf1，ABB92837.1）均下載自美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）。蛋白序列比對采用Clustal X和GENEDOC軟件。結(jié)構(gòu)域預(yù)測使用在線工具SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/），跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測使用在線工具TMHMM Server v. 2.0（http://www.cbs.dtu. k/services/TMHMM/），信號肽預(yù)測使用在線工具SignalP 4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/）。分析獲得數(shù)據(jù)利用Adobe Illustrator CS6軟件進行匯總作圖。

1.4 家蠶感染與材料收集

將保存的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌種子分別接種于LB培養(yǎng)基，在37℃于300 r/min過夜培養(yǎng)，當(dāng)OD600達到0.6—0.8時，取適量培養(yǎng)液5 000 r/min離心收集菌體，用預(yù)冷的1×PBS反復(fù)洗滌若干次后重懸于1×PBS中。利用血球計數(shù)板進行技術(shù)，將菌液稀釋至108個/mL。取5齡第2天家蠶幼蟲110頭，分為3組：第1組10頭，每頭注射10 μL的高壓滅菌1×PBS作為對照；第2組50頭，每頭注射10 μL的大腸桿菌；第3組50頭，每頭注射10 μL的金黃色葡萄球菌。于注射3、6、12、24和48 h后分別收集各組血細胞（其中對照組只收集注射后3 h一個時間點），加入1 mL Trizol混合均勻后保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 總RNA的提取及cDNA的合成

將-80℃保存的加入Trizol裂解液的樣本取出置于冰上，待樣品完全溶解后提取總RNA，利用1%的瓊脂糖膠和紫外分光光度計對提取的總RNA的純度與濃度進行檢測。然后參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的說明書進行反轉(zhuǎn)，獲得第一鏈cDNA。

1.6 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR所用試劑為promega公司的GoTaq? qPCR Master Mix，檢測儀器為Roche公司的LightCycler 96。定量PCR反應(yīng)體系：2×GoTaq? Probe qPCR Master Mix 10 μL，cDNA模板2 μL，擴增上下游引物各0.4 μL，無核酸酶水7.2 μL。整合素2的定量檢測引物為2-qF：GTATTGATTGGCTTGCTGAC TCTC和2-qR：GCTTCTTCCACTTTCCTGTATTCC，家蠶看家基因作為內(nèi)參，其引物為- qF：CATTCCGCGTCCCTGTTGCTAAT和- qR：GCTGCCTCCTTGACCTTTTGC。定量PCR的反應(yīng)采用“兩步法”，具體條件為95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃結(jié)合與延伸30 s，循環(huán)數(shù)為45次。

1.7 PCR擴增與載體構(gòu)建

質(zhì)粒由重慶威士騰生物構(gòu)建，具體的構(gòu)建方式如下：利用Primer 5.0設(shè)計PCR擴增引物，對整合素2的胞外域部分進行擴增，引物為2-F（RI）：GACTTCCATTTGTGGACAGTTCA和2-R（I）：CCGTAGCTTTAGGCGGTATCTG CT。擴增產(chǎn)物進行切膠回收后連接至PMD19-T載體，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞后挑取單斑，經(jīng)測序獲得無突變的單克隆T-2。擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，利用限制性內(nèi)切酶RI和I對T-2和pET22b質(zhì)粒分別進行酶切，利用1%的瓊脂糖膠分別回收對應(yīng)的整合素2和pET22b酶切片段。參照說明書，利用T4 DNA連接酶對酶切回收的pET22b和整合素2進行連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化和陽性克隆篩選獲得pET22b-2重組質(zhì)粒。

1.8 重組蛋白的表達與純化

將pET22b-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進大腸桿菌Rosetta (DE3)感受態(tài)，挑取單克隆，經(jīng)菌液PCR驗證后擴大培養(yǎng)。取高壓滅菌試管，分別加入10 mL新鮮培養(yǎng)后，各接種1 mL新培養(yǎng)的菌種，然后置于37℃ 300 r/min的條件下進行培養(yǎng)，待OD600達到0.6—0.8時，向各個培養(yǎng)管中分別加入不同終濃度的IPTG，16℃誘導(dǎo)20 h。于10 000 r/min 4℃離心培養(yǎng)液，收集菌體，棄上清后用預(yù)冷的1×PBS反復(fù)洗滌菌體，最后用1.5 mL 1×PBS懸浮菌體，經(jīng)高壓破碎處理后高速離心，分別收集上清蛋白和包涵體蛋白，包涵體用適量1×PBS重懸。取15 μL蛋白樣品，加入5 μL 4×SDS PAGE上樣緩沖液混勻后，煮沸變性30 min，進行SDS-PAGE電泳，電泳完成后利用考馬斯亮藍進行染色。通過對結(jié)果進行分析，發(fā)現(xiàn)0.2 mmol·L-1的IPTG濃度條件下，即可獲得含量較高的重組蛋白，所有大規(guī)模誘導(dǎo)的條件最終確定為IPTG濃度0.2 mmol·L-1，誘導(dǎo)溫度16℃，誘導(dǎo)時間20 h。利用Ni+親和層析對大規(guī)模誘導(dǎo)獲得的重組蛋白進行純化，在純化過程中收集不同處理階段的樣品，利用SDS-PAGE電泳進行檢測。

1.9 Western blot檢測

利用Western blot技術(shù)對純化獲得的重組蛋白進行檢測，Western blot檢測由重慶威士騰生物提供，具體方法如下：取5 μg BSA和純化的重組蛋白進行SDS-PAGE電泳，電泳完成后取出膠，進行轉(zhuǎn)膜，將膠上的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。利用5%的BSA于室溫封閉PVDF膜2—3 h后，換為6×His-tag抗體（碧云天，1﹕1 000）或anti-Integrin2抗體（課題組前期制備，1﹕2 000），4℃孵育過夜。1×TBST洗滌3×10 min，加入HRP標記的二抗室溫孵育2—3 h后，用1×TBST洗滌3×10 min。利用western blot超敏顯色試劑盒對條帶進行顯色并收集圖片。

1.10 ELISA檢測

將5 μg的LPS或PGN加入新的96孔板中，置于37℃恒溫箱過夜孵育，使得水分完全揮發(fā)，然后60℃處理30 min。用TBS緩沖液配制終濃度為600 μg·mL-1的BSA封閉液，按照每孔200 μL的量加至孔中，37℃恒溫孵育2 h。用TBS緩沖液多次洗滌后，加入終濃度分別為0、1、2、4、8、12和24 μg·mL-1的重組蛋白。室溫孵育3 h后用TBS緩沖液多次洗滌，每孔加入100 μL的6×His-tag（1﹕1 000）稀釋液，37℃孵育1 h。經(jīng)TBS緩沖液多次洗滌后，每孔加入50 μL TMB顯色液，室溫避光顯色20 min后加入2 mol·L-1H2SO4終止反應(yīng)，于450 nm處測定吸光值。

1.11 細菌結(jié)合試驗

檢測重組蛋白與兩種革蘭氏陰性菌（大腸桿菌和綠膿桿菌）和兩種革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌）的結(jié)合情況。將上述4種菌分別接種至LB培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)后收集菌液，以1 000×離心10 min后用TBS緩沖液反復(fù)洗滌，最后用適量TBS重懸。取10 μL菌（107個）和5 μg重組蛋白混勻后置于4℃，輕輕搖晃過夜。菌體用TBS緩沖液洗滌數(shù)次后加入5 μL的TBS緩沖液重懸，然后加入5 μL 4×SDS PAGE上樣緩沖液混勻并煮沸變性30 min。后續(xù)western blot 參照材料與方法1.9部分。

1.12 細菌凝集試驗

細菌凝集試驗共分為4組，第1組取25 μL重懸于TBS緩沖液的金黃色葡萄球菌（106個），加入等體積的BSA蛋白（100 μg·mL-1）；第2組在菌中加入至終濃度為10 mmol·L-1Ca2+；第3組在菌中加入等體積的重組蛋白；第4組在菌中加入等體積的純化的重組蛋白和終濃度為10 mmol·L-1的Ca2+。室溫孵育1 h后，將菌液涂抹至載玻片，待樣品完全風(fēng)干后置于顯微鏡下觀察。

1.13 體內(nèi)細菌清除

700 μL純化的重組蛋白（500 μg·mL-1）與等體積的金黃色葡萄球菌（107個），輕柔混勻后室溫放置30 min，期間輕輕顛倒混勻數(shù)次，以等量的BSA作為陰性對照。取5齡第3天家蠶幼蟲54頭，隨機平分為兩組，每組27頭。第1組每個個體分別注射50 μL的重組蛋白與菌體混合液；第2組每個個體分別注射50 μL的BSA與菌體混合液。注射2、15和30 min后，刺破幼蟲足部，3頭為一組收集血淋巴，每個試驗組設(shè)置3次重復(fù)。取50 μL血淋巴加入450 μL預(yù)冷PBS（含苯基硫脲），混勻后取100 μL涂布至LB固定平板，37℃培養(yǎng)過夜，次日對菌落進行計數(shù)統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 家蠶整合素β2序列特征

在課題組前期的研究中，克隆得到家蠶整合素2和3的全長cDNA序列，利用實時熒光定量PCR對其表達情況進行研究，發(fā)現(xiàn)這兩個基因均特異性高表達于血細胞[11]。家蠶整合素2基因全長為6 311 bp，包含8個外顯子和7個內(nèi)含子，其cDNA全長為2 434 bp，5′和3′ UTR分別為118和72 bp。整合素2的蛋白編碼區(qū)（coding sequence，CDS）長度為2 244 bp，編碼747 氨基酸殘基（amino acid，AA）的多肽，預(yù)測蛋白質(zhì)分子量84.42 kD，等電點5.349。與其他整合素亞基成員相似，家蠶整合素2蛋白由一段較長的胞外域、單次跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembrane，TM）和一段較短的胞內(nèi)域（cytoplasmic tail，CD）構(gòu)成，其中信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域分別位于第1—19和678—700位氨基酸殘基之間。整合素2與其他昆蟲亞基具有一定的保守性，與家蠶整合素3、煙草天蛾整合素1和草地貪夜蛾1的相似度分別為29%、45%和40%。比對結(jié)果顯示，家蠶整合素2上存在金屬離子結(jié)合位點MIDAS、EGF結(jié)構(gòu)域、半胱氨酸重復(fù)基序和NPxY等整合素非常保守的結(jié)構(gòu)域或基序。利用NetNGlyc 1.0 server在線工具預(yù)測相關(guān)蛋白的糖基化位點，在家蠶整合素2預(yù)測得到5個糖基化位點，分別位于第204、396、408、626和647位氨基酸殘基，其中后3個位點具有較高的保守性（圖1）。

“*”：保守的氨基酸殘基 Positions with identical residues；“：”：保守性置換 Positions with conservative substitutions；黑色加粗字體 The black bold fonts：預(yù)測的N-糖基化位點The predicted N-glycosylation sites； MIDAS：MIDAS基序MIDAS motif within the I-like domain；I-like：I-like結(jié)構(gòu)域I-like domain；EGF：EGF結(jié)構(gòu)域EGF-like domain；Cys-repeats：半胱氨酸重復(fù)基序 The four cysteine-rich pseudo-repeats；TM：跨膜結(jié)構(gòu)域 Transmembrane domain；CD：胞內(nèi)域Cytoplasmic domain；NPxY：NPxY模式NPxY motif

2.2 家蠶整合素β2在細菌感染后的表達變化

血細胞是一類重要的免疫細胞，在發(fā)育變態(tài)和免疫防御中發(fā)揮重要的作用。為了探究家蠶整合素2可能扮演的角色，分別利用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌對5齡第2天幼蟲進行病原菌誘導(dǎo)。如圖2-A所示，在大腸桿菌誘導(dǎo)3 h后，整合素2開始上調(diào)表達，至6 h時，上調(diào)趨勢達到峰值，隨后迅速降低。而用金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)后，整合素2也從3 h開始上調(diào)表達，至12 h時達到峰值，隨后下調(diào)（圖2-B）。上述結(jié)果表明大腸桿菌和金黃色葡萄球菌可以誘導(dǎo)家蠶整合素2的表達。

2.3 家蠶整合素β2重組蛋白的表達與純化

為了進一步探索家蠶整合素2的功能，嘗試利用原核表達獲得體外重組蛋白。截取編碼第20—676位氨基酸殘基的cDNA序列，該序列長度為1 971 bp，編碼657 AA的氨基酸，屬家蠶整合素2完整的胞外域部分（圖3-A）。將該DNA片段插入表達質(zhì)粒pET22b后，轉(zhuǎn)化進入Rosetta (DE3)感受態(tài)細胞，成功獲得含有pET22b-β2重組質(zhì)粒的表達菌株。0.2和0.4 mmol·L-1的IPTG均能誘導(dǎo)重組蛋白的表達（圖3-B）。最終選擇16℃，IPTG濃度為0.2 mmol·L-1的條件下大規(guī)模誘導(dǎo)目的重組蛋白的表達。對收集獲得的蛋白，利用鎳離子親和層析的方法進行純化，隨后利用SDS-PAGE對純化獲得的蛋白進行檢測，發(fā)現(xiàn)40、60和100 mmol·L-1的咪唑洗脫濃度可獲得純度較高的整合素2重組蛋白（圖3-C）。純化蛋白的N和C端均包含一個His標簽，根據(jù)這一特性，利用His標簽抗體對重組蛋白進行western blot檢測。純化獲得的重組蛋白樣品有一條明顯的蛋白條帶（圖3-D）。為了進一步證實重組蛋白的特異性，利用前期制備的anti-integrin2抗體進行進一步的western blot檢測，確認重組蛋白為后續(xù)試驗所需要的目的靶蛋白（圖3-E）。

2.4 整合素β2重組蛋白與病原相關(guān)分子模式（pathogen- associated molecular patterns，PAMPs）的結(jié)合

采用ELISA方法探究家蠶整合素2能否與病原相關(guān)分子模式結(jié)合。LPS是位于革蘭氏陰性細菌細胞壁最外層的一層較厚的類脂多糖，而PGN（本文指Lys-type PGN）是革蘭氏陽性細菌細胞壁的主要組成成分。如圖4所示，家蠶整合素2重組蛋白與對照樣品BSA的結(jié)合能力很弱，而與PGN和LPS的結(jié)合能力很強，且呈現(xiàn)明顯的濃度梯度依賴效應(yīng)。PGN和LPS相比，PGN與重組蛋白的結(jié)合能力要強于LPS。

2.5 整合素β2重組蛋白與病原菌的結(jié)合

運用Western blot檢測重組蛋白與兩種革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌）和兩種革蘭氏陰性菌（大腸桿菌和綠膿桿菌）的結(jié)合能力。如圖5所示，4種檢測的病原菌均在與整合素2重組蛋白同樣大小的位置上出現(xiàn)條帶，說明整合素2重組蛋白與金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和綠膿桿菌均發(fā)生結(jié)合。相比較而言，重組蛋白與兩種革蘭氏陽性菌的結(jié)合能力要顯著強于兩種革蘭氏陰性菌。

*P＜0.05，**P＜0.01，統(tǒng)計學(xué)分析用t檢驗 *P＜0.05 vs control PBS, **P＜0.01 vs control PBS, Student’s t-test (n=3)

A：整合素β2蛋白結(jié)構(gòu)域分析，重組蛋白包含完整的胞外域部分（信號肽除外）The protein structure domain analysis of integrin β2, the recombinant proteins contain the complete extracellular domain (except for the signal peptide)。B：整合素β2在大腸桿菌中的表達Induction of the integrin β2 protein in E. coli。M：蛋白分子標準Marker；“↑”：重組菌的上清蛋白 The soluble fraction of recombinant E. coli；“↓”：重組菌的包涵體蛋白 The inclusion body of recombinant E. coli。C：整合素β2重組蛋白的純化Purification of the integrin β2 recombinant protein。M：蛋白分子標準Marker；1：重組菌的包涵體蛋白 The inclusion body of recombinant E. coli；2：重組菌的上清蛋白 The soluble fraction of recombinant E. coli；3、4：上柱前蛋白 The proteins before purified by NTA-Ni affinity chromatography；5：流出液 Outflow；6：20 mmol·L-1咪唑 Imidazole at 20 mmol·L-1；7：40 mmol·L-1咪唑 Imidazole at 40 mmol·L-1；8：60 mmol·L-1咪唑 Imidazole at 60 mmol·L-1；9：100 mmol·L-1咪唑 Imidazole at 100 mmol·L-1；10：200 mmol·L-1咪唑 Imidazole at 200 mmol·L-1。D、E：Western blot檢測純化重組蛋白，檢測抗體為His標簽或anti-integrin β2抗體 The purified recombinant proteins detected by western blot, and the His-tag antibody or anti-integrin β2 used in this study。1：未誘導(dǎo)的菌體蛋白 Uninduced bacteria protein；2：誘導(dǎo)的菌體蛋白 Induced bacteria protein；3：純化獲得的整合素β2重組蛋白 The purified recombinant integrin β2 protein

BSA作為對照BSA used as the control

1：未結(jié)合蛋白Unbinding protein；2：第一次洗脫First elution；3：第二次洗脫Second elution；4：菌體結(jié)合蛋白Bacterial binding protein

2.6 整合素β2重組蛋白促進細菌凝聚反應(yīng)

為了進一步檢測整合素2在免疫反應(yīng)中的功能，進行了細菌凝集分析。結(jié)果顯示整合素2重組蛋白對金黃色葡萄球菌具有一定的凝聚作用，而同時添加Ca2+后，重組蛋白對金黃色葡萄球菌具有很強的凝聚作用（圖6）。檢測重組蛋白對大腸桿菌的凝聚作用，發(fā)現(xiàn)在Ca2+的激活下，重組蛋白也可以促進大腸桿菌的凝聚，但其凝聚效果要弱于金黃色葡萄球菌（數(shù)據(jù)未列出）。

2.7 整合素β2促進體內(nèi)細菌清除

前期試驗數(shù)據(jù)顯示整合素2可能通過與病原相關(guān)分子模式（PAMPs）相互結(jié)合而實現(xiàn)對細菌的識別，因此推測整合素2可能參與機體對外源入侵細菌的清理。利用細菌清理試驗檢測BSA或整合素2重組蛋白（rIntegrin2）處理金黃色葡萄球菌后，有機體對細菌的殺傷情況。如圖7所示，細菌體內(nèi)注射15 min后，BSA處理組大約有83%的細菌存活，而重組蛋白處理組只有66%的細菌存活，細菌存活率下降了17%，差異顯著（＜0.05）。而注射30 min后，相應(yīng)的細菌生存率分別降至66%和48%，重組蛋白處理組相比BSA處理組下降了18%，差異顯著（＜0.05）。

圖6 整合素β2重組蛋白對金黃色葡萄球菌的凝聚作用

圖7 整合素β2重組蛋白體內(nèi)清除細菌活性檢測

3 討論

整合素是一類跨膜糖蛋白異源二聚體，廣泛存在于各物種中，在多種正常生理和病理中發(fā)揮著重要的作用。目前在多種昆蟲中整合素基因得到鑒定，但除果蠅外，整合素在昆蟲中的研究停留在基因克隆和簡單的功能研究。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，對整合素2的功能進行探索。整合素2是一個在血細胞中高表達的整合素成員之一[11]，課題組前期研究結(jié)果顯示整合素PS3在血細胞中也具有較高的表達特異性，可能參與調(diào)控血細胞對外源物的吞噬與包囊[12,30]，因此推測整合素2在血細胞參與的免疫反應(yīng)中也可能發(fā)揮著重要的作用。整合素2具有整合素亞基保守的結(jié)構(gòu)特征和功能性基序（圖1），暗示整合素具有高度的保守性。

為了探索整合素2在免疫反應(yīng)中的功能，首先利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測受到不同病原微生物刺激后血細胞中整合素2表達水平的變化，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均能夠顯著誘導(dǎo)其表達（圖2），暗示整合素2可能廣泛參與血細胞對各種病原微生物入侵的免疫應(yīng)答。為了進一步探索整合素2在免疫反應(yīng)中的角色與功能，截取了完整的胞外域區(qū)域進行原核誘導(dǎo)，通過親和層析方法獲得高純的重組蛋白，該蛋白為探索整合素2的功能提供了便利。在整合素的研究中，體外重組蛋白是一種有用的研究材料。Zhang等[32]利用相似的方法獲得南美白對蝦（）整合素的重組蛋白rLvIntegrin，發(fā)現(xiàn)rLvIntegrin具有細菌凝聚和促進NIH3T3細胞增殖的能力。筆者課題組前期利用不同的原核表達載體和誘導(dǎo)條件，嘗試誘導(dǎo)可溶性重組蛋白的表達，但均表達于包涵體。Wang等成功利用包涵體形式的體外重組蛋白對刺參（）和中華絨螯蟹（）中整合素相關(guān)免疫功能進行探究[33-34]。

整合素具有結(jié)合各種PAMPs的能力，牡蠣（）整合素Cg Integrin證實是一種模式識別受體，能夠結(jié)合與識別LPS[35]，一種日本刺參（）也具有與LPS結(jié)合的能力[33]。而中華絨螯蟹整合素成員EsIntegrin通過直接結(jié)合LPS和PGN能夠協(xié)助機體清除多種病原菌[34]。這些研究結(jié)果都提示整合素可以作為一種模式識別受體，通過與各種病原菌和病原分子模式直接結(jié)合而參與免疫反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，家蠶整合素2的純化重組蛋白可以與多種病原菌和病原分子模式結(jié)合，其中與革蘭氏陽性菌和其相應(yīng)的病原分子模式的結(jié)合能力要強于陰性菌的，提示家蠶整合素2也是一種病原分子模式。本研究只檢測了4種病原微生物，下一步還需要檢測整合素2與更多類型病原菌的結(jié)合情況。

4 結(jié)論

整合素2具有典型的整合素亞基結(jié)構(gòu)特征，推測其具有整合素家族保守的功能。病原微生物能夠顯著誘導(dǎo)整合素2在血細胞的表達，利用原核表達系統(tǒng)成功獲得重組蛋白，通過蛋白純化獲得高純的重組蛋白。重組蛋白能夠與LPS、PGN等病原相關(guān)分子模式（PAMPs）結(jié)合，表明整合素2可能是一種模式識別受體。重組蛋白與革蘭氏陽性菌的結(jié)合能力要強于陰性菌，對不同的病原入侵微生物具有不同程度的凝聚作用。整合素2具有識別和結(jié)合PAMPs能力，通過與細菌的直接結(jié)合而實現(xiàn)對入侵病原微生物的凝聚作用，進而在細菌免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

[1] Takada Y, Ye X, Simon S. The integrins., 2007, 8(5): Article 215.

[2] Giancotti F G. A structural view of integrin activation and signaling., 2003, 4(2): 149-151.

[3] Hughes A L. Evolution of the integrinandprotein families., 2001, 52(1): 63-72.

[4] Banno A, Ginsberg M H. The ins and outs of integrin signaling// Laflamme S E, Kowalczyk A P.. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2008: 1-23.

[5] Hood J D, Cheresh D A. Role of integrins in cell invasion and migration., 2002, 2(2): 91-100.

[6] Huttenlocher A, Horwitz A R. Integrins in cell migration., 2011, 3(9): a005074.

[7] Brooks P C, Montgomery A M, Rosenfeld M, Reisfeld R A, Hu T, Klier G, Cheresh D A. Integrinv3 antagonists promote tumor regression by inducing apoptosis of angiogenic blood vessels., 1994, 79(7): 1157-1164.

[8] Meredith J E, Schwartz M A. Integrins, adhesion and apoptosis., 1997, 7(4): 146-150.

[9] Giancotti F G, Ruoslahti E. Integrin signaling., 1999, 285(5430): 1028-1032.

[10] Desgrosellier J S, Cheresh D A. Integrins in cancer: biological implications and therapeutic opportunities., 2010, 10(1): 9-22.

[11] Zhang K, Xu M, Su J, Yu S, Sun Z, Li Y, Zhang W, Hou J, Shang L, Cui H. Characterization and identification of the integrin family in silkworm,., 2014, 549(1): 149-155.

[12] Zhang K, Tan J, Man X, Su J, Hu R, Chen Y, Fan X, Rui Y, Cui H. A novel granulocyte-specificintegrin is essential for cellular immunity in the silkworm., 2014, 71: 61-67.

[13] Zhang K, Tan J, Su J, Liang H, Shen L, Li C, Pan G, Yang L, Cui H. Integrin3 plays a novel role in innate immunity in silkworm,., 2017, 77: 307-317.

[14] 孫亞蘭. 家蠶整合蛋白基因的克隆及其表達分析[D]. 武漢: 華中師范大學(xué), 2009.

SUN Y L. cDNA cloning and gene expression of integrinsubunits from[D]. Wuhan: Central China Normal University, 2009. (in Chinese)

[15] Nagaosa K, Okada R, Nonaka S, Takeuchi K, Fujita Y, Miyasaka T, Manaka J, Ando I, Nakanishi Y. Integrinν-mediated phagocytosis of apoptotic cells inembryos., 2011, 286(29): 25770-25777.

[16] Xie X, Auld V J. Integrins are necessary for the development and maintenance of the glial layers in theperipheral nerve., 2011, 138(17): 3813-3822.

[17] Zusman S, Grinblat Y, Yee G, Kafatos F C, Hynes R O. Analyses of PS integrin functions duringdevelopment., 1993, 118(3): 737-750.

[18] Bunch T A, Graner M W, Fessler L I, Fessler J H, Schneider K D, Kerschen A, Choy L P, Burgess B W, Brower D L. The PS2 integrin ligand tiggrin is required for proper muscle function in., 1998, 125(9): 1679-1689.

[19] Brown N H. Cell-cell adhesion via the ECM: integrin genetics in fly and worm., 2000, 19(3): 191-201.

[20] Schotman H, Karhinen L, Rabouille C. dGRASP- mediated noncanonical integrin secretion is required forepithelial remodeling., 2008, 14(2): 171-182.

[21] Lin G, Zhang X, Ren J, Pang Z, Wang C, Xu N, Xi R. Integrin signaling is required for maintenance and proliferation of intestinal stem cells in., 2013, 377(1): 177-187.

[22] Lavine M D, Strand M R. Haemocytes fromexpress multipleandintegrin subunits., 2003, 12(5): 441-452.

[23] Pech L L, Strand M R. Encapsulation of foreign targets by hemocytes of the moth(Lepidoptera: Noctuidae) involves an RGD-dependent cell adhesion mechanism., 1995, 41(6): 481-488.

[24] Mahairaki V, Lycett G, Sidén-Kiamos I, Sinden R E, Louis C. Close association of invadingandintegrin in themidgut., 2005, 60(1): 13-19.

[25] Moita L F, Vriend G, Mahairaki V, Louis C, Kafatos F C. Integrins ofand a putative role of a new beta integrin, BINT2, in phagocytosis of., 2006, 36(4): 282-290.

[26] Mamali I, Lamprou I, Karagiannis F, Karakantza M, Lampropoulou M, Marmaras V J. Aintegrin subunit regulates bacterial phagocytosis in medfly haemocytes., 2009, 33(7): 858-866.

[27] Hu J, Zhao H, Yu X, Liu J, Wang P, Chen J, Xu Q, Zhang W. Integrin1 subunit fromhemocytes: molecular characterization, expression, and effects on the spreading of plasmatocytes., 2010, 56(12): 1846-1856.

[28] Xu Q, Yu X, Liu J, Zhao H, Wang P, Hu S, Chen J, Zhang W, Hu J.integrin1 may be involved in polymerization of actin to modulate spreading and encapsulation of plasmatocytes., 2012, 37(3/4): 438-445.

[29] Levin D M, Breuer L N, Zhuang S, Anderson S A, Nardi J B, Kanost M R. A hemocyte-specific integrin required for hemocytic encapsulation in the tobacco hornworm,., 2005, 35(5): 369-380.

[30] 談娟, 張奎, 徐曼, 陳思源, 崔紅娟. 家蠶整合素基因的鑒定及亞細胞定位. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 46(22): 4808-4815.

TAN J, ZHANG K, XU M, CHEN S Y, CUI H Y. Identification and subcelluar localization offrom silkworm ()., 2013, 46(22): 4808-4815. (in Chinese)

[31] 李重陽, 張奎, 申利, 趙羽卒, 潘光照, 徐曼, 蘇晶晶, 崔紅娟. 家蠶整合素1基因的克隆及表達. 生物工程學(xué)報, 2017, 33(12): 1955-1967.

Li C Y, Zhang K, Shen L, ZHAO Y Z, PAN G Z, XU M, SU J J, CUI H Y. Cloning and expression ofsilkworm., 2017, 33(12): 1955-1967. (in Chinese)

[32] Zhang Y, Wang L, Wang L, Wu N, Zhou Z, Song L. An integrin from shrimpmediated microbial agglutination and cell proliferation., 2012, 7(7): e40615.

[33] Wang Z, Shao Y, Li C, Lv Z, Wang H, Zhang W, Zhao X. A-integrin from sea cucumberexhibits LPS binding activity and negatively regulates coelomocyte apoptosis., 2016, 52: 103-110.

[34] HUANG Y, Zhao L L, Feng J L, Zhu H X, HUANG X, REN Q, Wen W. A novel integrin function in innate immunity from Chinese mitten crab ()., 2015, 52(2): 155-165.

[35] Jia Z, Zhang T, Jiang S, Wang M, Cheng Q, Sun M, Wang L, Song L. An integrin from oystermediates the phagocytosis towardthrough LPS binding activity., 2015, 53(1): 253-264.

Expression, purification and immunologic function of Integrin2 in the silkworm ()

ZHANG Kui, LI Chongyang, SU Jingjing, TAN Juan, XU Man, CUI Hongjuan

(State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Southwest University, Chongqing 400716)

【Objective】The objective of this study is to analyze the gene sequence and structural characteristics of integrin2 in silkworm (), and its expression profile in hemocytes following the larval exposure to different bacterial pathogens, investigate the binding and agglutination properties of the recombinant integrin2 protein to various pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) and bacteria, which will lay a foundation for further exploring the protein function of integrin2 in. 【Method】Bioinformatics tools were used to determine the sequence and structural characteristics of integrin2, and real-time fluorescent quantitative PCR (RT-qPCR) assay was executed to evaluate expression profile in hemocytes after microbial (and) challenge. The cDNA fragment of integrin2 was amplified using PCR, and the fragment containing the extracellular domain was inserted into a prokaryotic expression vector (pET22b). The insertion was confirmed in the recombinant plasmid and transformed intoRosetta (DE3), and then induced by IPTG to produce recombinant protein. The recombinant protein was purified using Ni-NTA affinity chromatography and analyzed by SDS-PAGE and western blot. ELISA and western blot were executed to determine the binding abilities of the recombinant protein to PAMPs (LPS and PGN) and different bacteria. Moreover, the agglutination ability and bacterial clearance assay were performed to understand the specific biological roles of integrin2 in immunity.【Result】integrin2 contains typical integrinsubunits, which comprises a long extracellular domain, a single transmembrane region and a short cytoplasmic tail. Further, it has several conserved motifs such as the MIDAS, EGF domain, Cys-repeat sequences and NPxY motifs. The RT-qPCR analysis showed that theexpression varied significantly in hemocytes after infection with bacteria. High purity recombinant protein was obtained by prokaryotic expression and protein purification. The results of SDS-PAGE and Western blot showed that the purified recombinant protein was of high purity and could be used in subsequent tests. ELISA assay indicated that the purified recombinant integrin2 protein had a strong binding ability to PAMPs (LPS and PGN). The results of bacterial binding test showed that the recombinant protein could bind many bacteria, but the binding ability with Gram-positive bacteria was higher than that with Gram-negative bacteria. The agglutination assay showed that the recombinant protein had strong agglutination effects onin the presence of ca2+. Further, bacterial clearance assay suggested that the recombinant protein could effectively promote the cleaning of exogenous invading bacteria from. 【Conclusion】The integrin2 has a typical structure of theintegrin family, and it can recognize PAMPs (LPS and PGN) and enhance the aggregation of invading microbial pathogens by directly binding to them. Taken together, integrin2 may play an important biological role in the bacterial immune response of.

; integrin2; microbial challenge; prokaryotic expression; bacterial agglutination

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.01.016

2018-08-08；

2018-08-24

國家自然科學(xué)基金（31802142）、中國博士后科學(xué)基金（2017M620408）、重慶市自然科學(xué)基金（cstc2016jcyjA0425）、重慶高校創(chuàng)行團隊建設(shè)基金（CXTDX201601010）

張奎，Tel：023-68253750；E-mail：Zhangk87@gmail.com，Zhangk87@163.com。通信作者崔紅娟，Tel：023-68251713；E-mail：Hongjuan.cui@gmail.com，hcui@swu.edu.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）