D-Optional混料設(shè)計優(yōu)化油茶殼瓶栽海鮮菇配方

盧劍青， 艾嘯威， 胡冬南， 沈勇根， 周 明， 朱鳳妮， 王 強(qiáng)

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗室，江西南昌 330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江西南昌 330045)

油茶(CamelliaOleiferaAbel)別稱茶油樹，為山茶科山茶屬植物，同油棕、椰子、油橄欖一起被人們譽(yù)為世界四大木本油料樹種[1]。據(jù)報道，中國是世界上油茶品種最多、種植面積最大、分布最廣、茶籽產(chǎn)量亦是最高的國家，已有 26.67萬hm2的油茶林種植面積[2]。油茶殼含油率低、木質(zhì)素高，將油茶籽帶殼加工制油，不僅會增大對設(shè)備的損耗，而且還會降低茶油的品質(zhì)，所以在制油工業(yè)中都是對油茶籽進(jìn)行脫殼處理，油茶殼成了茶油加工中的主要廢棄物。海鮮菇[Hypsizygusmarmoreus(Peck) H.E.Bigelow]是一種珍稀的食用菌，其商品名為真姬菇，別稱白玉菇、玉蕈、斑玉蕈或蟹味菇等。海鮮菇整體顏色潔白，菇柄筆直，外形十分美觀，口感爽滑、脆嫩，味道鮮美。海鮮菇風(fēng)味鮮美類似海蟹風(fēng)味、營養(yǎng)價值高，并且海鮮菇還有著很高的藥用價值，經(jīng)國內(nèi)外對海鮮菇的研究發(fā)現(xiàn)，海鮮菇子實(shí)體中含有多種生物活性物質(zhì)，如具有清除自由基[3]、抗腫瘤[4]以及調(diào)節(jié)免疫活性[5]等生理功能，近年來廣受大眾歡迎。將油茶殼廢料應(yīng)用到食用菌生產(chǎn)中作栽培基質(zhì)，在獲得風(fēng)味獨(dú)特的食用菌同時，消化油茶加工過程中產(chǎn)生的剩余物，使資源得到充分高效循環(huán)利用。大量研究表明，油茶殼經(jīng)過堆漚發(fā)酵后，碳氮比會降低(即油茶殼的含氮量提高)，顆粒度變小使保水能力增強(qiáng)，經(jīng)過半年的發(fā)酵，油茶殼的碳氮比高達(dá)21.42 ∶1，發(fā)酵后的油茶殼很適合用作食用菌的栽培原料[6]。這在鳳尾菇[7]、黑木耳[8]、香菇[9]、金針菇[10]、平菇[11]等幾種食用菌的栽培中已有應(yīng)用，并且使用油茶殼栽培食用菌后，食用菌生長速率快、產(chǎn)量高、生物學(xué)效率高、品質(zhì)好。目前，在海鮮菇生產(chǎn)企業(yè)中主要采用棉籽殼來栽培海鮮菇，但棉籽殼的原料價格一直居高不下，海鮮菇的經(jīng)濟(jì)收益低，因此海鮮菇科技工作者開始研究新型栽培料代替?zhèn)鹘y(tǒng)原料來生產(chǎn)海鮮菇，以降低海鮮菇生產(chǎn)成本，提高效率。本研究將油茶殼應(yīng)用到海鮮菇生產(chǎn)中作栽培基質(zhì)，采用混料設(shè)計方法，以油茶殼、棉籽殼、混合料(木屑、麥麩、玉米粉)為主要原料，以栽培周期、產(chǎn)量、子實(shí)體農(nóng)藝性狀和營養(yǎng)價值為評價指標(biāo)，設(shè)計16組配方進(jìn)行栽培試驗，分析并篩選出適宜海鮮菇工廠化栽培的優(yōu)勢配方。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海鮮菇菌種，由江西星火農(nóng)林科技有限公司提供；油茶殼，經(jīng)堆漚發(fā)酵，由江西星火農(nóng)林科技有限公司提供；海鮮菇母種培養(yǎng)基包括馬鈴薯200 g、瓊脂粉18 g、葡萄糖20 g、水 1 000 mL 等，市購；海鮮菇原種培養(yǎng)基包括棉籽殼26.7%、木屑53.3%、玉米粉3.3%、麥麩16.7%，其中石灰粉和石膏粉的用量占培養(yǎng)基干質(zhì)量的1%，市購；海鮮菇栽培種培養(yǎng)基包括油茶殼、棉子殼、雜木屑、麥麩粉、玉米粉、石灰粉，棉籽殼和油茶殼作為主料，雜木屑、麥麩粉以及玉米粉按固定比例(4 ∶3 ∶1)混合作為混合料，市購；過氧化氫、氫氧化鈉、濃硫酸、濃鹽酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、無水乙醇、甲基紅、溴甲酚綠、過氧化氫、十二烷基三甲基溴化氨、正丁醇、丙酮、石油醚等，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺，上?？蹈Ｌ丨h(huán)境科技有限公司；HVE-50滅菌鍋，日本Hirayama制造有限公司；DHP-9272恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；BZ-10-12型馬弗爐，上海博珍儀器設(shè)備制造廠；BAS124S型分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；BZ-10-12型馬弗爐，上海博珍儀器設(shè)備制造廠；Foss8400型全自動凱氏定氮儀，廣東省廣州賽為思儀器設(shè)備有限公司；DT208型樣品消化爐，廣東省廣州賽為思儀器設(shè)備有限公司；SHZ-ⅢD型真空抽濾機(jī)，上海亞京生化儀器廠；HH-4型電熱水浴鍋，國華電器有限公司；HJ-3型磁力攪拌器，國華電器有限公司；101A-4B型電熱恒溫箱，上海市試驗儀器總廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 混料配方設(shè)計 采用D-Optional混料設(shè)計法，根據(jù)海鮮菇對碳源和氮源的營養(yǎng)需要，調(diào)整棉籽殼、油茶殼及混合料所占培養(yǎng)基干料的比例，石灰粉的添加量固定為培養(yǎng)基干質(zhì)量的1.4%，以期建立各因子對海鮮菇生長周期、產(chǎn)量及農(nóng)藝性狀的回歸方程，通過統(tǒng)計軟件來優(yōu)化海鮮菇的生產(chǎn)配方。在采用D-Optional優(yōu)化處方工藝前，各因素需要1個較優(yōu)范圍，以便于保證優(yōu)化設(shè)計的精確性。本研究前期通過查閱大量文獻(xiàn)以及根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)經(jīng)驗得出結(jié)果，將3種栽培料的添加量分別限定為：0≤棉籽殼添加量(A)≤70%，0≤油茶殼添加量(B)≤70%，30%≤混合料添加量(C)≤50%；A、B、C均為實(shí)際值，且A+B+C=1。根據(jù)D-Optional設(shè)計出16組配方，具體結(jié)果見表1。同時，以傳統(tǒng)未加油茶殼的配方(棉籽殼添加量65%、混合料添加量35%)進(jìn)行對比，每組配方做32次重復(fù)試驗。

表1 培養(yǎng)基配方設(shè)計

1.3.2 各級種子的制備

1.3.2.1 母種斜面的制備 先挑取母種轉(zhuǎn)接到馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上，于恒溫培養(yǎng)箱20～22 ℃遮光培養(yǎng)，3 d后母種萌發(fā)菌絲，15～20 d后雪白的菌絲長滿整個試管。將培養(yǎng)好的馬鈴薯瓊脂斜面培養(yǎng)基(PDA)試管的培養(yǎng)物放在4 ℃下保藏，作為母種斜面。

1.3.2.2 原種的制備 (1)培養(yǎng)基的制備。稱取200 kg棉籽殼、400 kg雜木屑分別先用水浸泡12 h以上，再將浸泡好的棉籽殼、雜木屑同125 kg麥麩、10 kg玉米粉、7.5 kg石灰粉以及7.5 kg石膏進(jìn)行攪拌均勻，加水至培養(yǎng)料的含水量為65%為止。隨后進(jìn)行裝瓶，于121～123 ℃下濕熱高壓滅菌處理20 min；待滅菌完成后，將培養(yǎng)料冷卻至室溫，方可用于后續(xù)接種試驗。(2)原種的制備。取出制備好的母種斜面試管，用接種環(huán)將母種斜面平均切成3～4塊，分別放入原種瓶中，每支母種斜面試管接3～4個原種瓶，最后將接種好的原種瓶直接擺放在原種培養(yǎng)房的培養(yǎng)架上，于22～25 ℃下暗培養(yǎng) 30～40 d，室內(nèi)的相對濕度(RH)控制在65%～75%。待培養(yǎng)好的原種瓶內(nèi)的培養(yǎng)物作為原種。

1.3.2.3 栽培種的制作 (1)拌料。將預(yù)先處理好的油茶殼、棉籽殼、雜木屑、麥麩、玉米粉栽培料、石灰粉按比例堆放在一起，用鐵鍬不斷攪拌均勻，加入適量水，直到混合料的含水量為65%上下為止。(2)裝瓶及接種。將拌好的混合料按300 g分裝于栽培瓶(1 100 mL)，且保證每瓶料的松緊度和高度一致，于121～123 ℃下高壓滅菌20 min。待滅菌完成且冷卻至室溫后，將制備好的原種接種于無菌的栽培瓶中，于培養(yǎng)室22～25 ℃下暗培養(yǎng)和后熟一段時間，且室內(nèi)的相對濕度控制在65%～75%。(3)搔菌。待海鮮菇成熟后進(jìn)行搔菌，將菌瓶放在搔菌機(jī)上，機(jī)器把菌瓶上部與瓶蓋接觸的那部分老菌絲挖掉，搔菌后每瓶加入10～15 mL的水，5 min后把水倒出，然后把菌瓶轉(zhuǎn)移至出菇房進(jìn)行出菇管理。為保證菌瓶正常出菇，將出菇房中的溫度控制在13～15 ℃，相對濕度控制在85%，再把無紡布蓋在菌瓶面上避免空調(diào)機(jī)吹出來的風(fēng)直接打在料面上。待3～5 d的暗培養(yǎng)后，用150～200 lx的光線對其進(jìn)行照射，10～15 d后瓶口出現(xiàn)小菇芽，可揭開無紡布，以保證正常出菇，此時將出菇房的相對濕度控制在90%。待海鮮菇菇帽出現(xiàn)菌環(huán)時，表明海鮮菇已經(jīng)成熟，必須馬上采摘，否者會形成“大帽子菇”影響海鮮菇的商品價值。

1.3.3 試驗各指標(biāo)測定方法

1.3.3.1 海鮮菇栽培周期指標(biāo)的測定方法 采用觀察法，觀察并記錄接種好的栽培瓶內(nèi)海鮮菇菌絲長滿至全瓶所需要的時間和出菇至菇芽成熟所需要的時間，這兩者之和即為海鮮菇的栽培周期。

1.3.3.2 海鮮菇子實(shí)體產(chǎn)量指標(biāo)的測定方法 子實(shí)體的產(chǎn)量采用直接稱質(zhì)量法，將采摘后的子實(shí)體用電子天平稱質(zhì)量。

1.3.3.3 海鮮菇子實(shí)體農(nóng)藝性狀指標(biāo)的測定方法 結(jié)合工廠生產(chǎn)對海鮮菇子實(shí)體實(shí)際需要，采用測量評分法，待出菇至菇芽成熟結(jié)束后，按表2進(jìn)行評分。

1.3.3.4 海鮮菇子實(shí)體營養(yǎng)指標(biāo)的測定方法 含水量參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》中直接干燥法進(jìn)行測定[12]；灰分含量的測定參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》中進(jìn)行測定[13]；粗蛋白質(zhì)含量參照GB 5009.5—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》中全自動凱氏定氮儀法進(jìn)行測定[14]；粗纖維含量采用酸性洗滌劑法進(jìn)行測定[15]；粗脂肪含量參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》中索氏提取法進(jìn)行測定[16]。

表2 子實(shí)體農(nóng)藝性狀的評分標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同配方海鮮菇子實(shí)體比較

不同配方海鮮菇子實(shí)體的生長情況見圖1。

2.2 不同配方對海鮮菇栽培周期、子實(shí)體產(chǎn)量及農(nóng)藝性狀的影響

將成熟的海鮮菇子實(shí)體采下，測量不同配方海鮮菇子實(shí)體的數(shù)量、菇柄直徑及其長度、菇帽的直徑，并根據(jù)表2中評分標(biāo)準(zhǔn)對海鮮菇子實(shí)體進(jìn)行評分，評分結(jié)果見表3。

2.2.1 不同配方對海鮮菇栽培周期回歸分析結(jié)果 根據(jù)所得到的試驗結(jié)果，對海鮮菇栽培周期的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合。根據(jù)擬合結(jié)果，該模型擬合有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.012 1<0.05)，對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程：y=48.882A+88.702B+10.478C-61.824AB+394.419AC+228.249BC。從表4可以看出該模型的P值=0.001 1，達(dá)顯著水平，失擬項為0.106 6，不顯著，確定系數(shù)R2=0.835 1>0.7，說明83.51%的試驗數(shù)據(jù)可以用該模型解釋，表明該模型擬合效果較好。

由圖2可知，當(dāng)混合料添加量占較大的比例，隨著棉籽殼添加量增加，海鮮菇的生長周期逐漸延長，隨著油茶殼的添加量不斷增加，海鮮菇的生長周期先是不斷縮短再開始緩慢延長，在油茶殼添加量為50%時，海鮮菇的生長周期最短。油茶殼經(jīng)過發(fā)酵后，原料的持水性得到提高，同時發(fā)酵后的油茶殼中的營養(yǎng)物質(zhì)易被海鮮菇菌絲吸收，隨著油茶殼的添加量增加，海鮮菇生長周期縮短，但是油茶殼添加量過高時，導(dǎo)致培養(yǎng)基整體的透氣性下降，影響海鮮菇菌絲正常生長。以海鮮菇子實(shí)體栽培周期為評價指標(biāo)，最佳栽培料的生產(chǎn)配方：油茶殼添加量為50%、棉籽殼添加量為0、混合料添加量為50%，并且預(yù)計海鮮菇最短栽培周期是107 d。

表3 不同配方栽培周期、子實(shí)體產(chǎn)量及農(nóng)藝性狀評分試驗結(jié)果

表4 栽培周期回歸分析結(jié)果

2.2.2 不同配方對海鮮菇子實(shí)體產(chǎn)量回歸結(jié)果 根據(jù)所得到的試驗結(jié)果，對海鮮菇子實(shí)體產(chǎn)量的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合。根據(jù)擬合結(jié)果可知，該模型擬合有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1)，對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程如下：y=91.876A+119.713B+173.053C+214.987AB+459.389AC。從表5中可以看出該模型P值<0.0001，達(dá)顯著水平，其決定系數(shù)R2=0.987>0.7，說明98.7%的試驗數(shù)據(jù)可以用該模型解釋，表明該模型擬合效果較好。

表5 子實(shí)體產(chǎn)量回歸分析結(jié)果

由圖3中可知，當(dāng)混合料添加量同時保持不變時，海鮮菇的產(chǎn)量隨著棉籽殼的添加量增加而增加，隨著油茶殼添加量的增加而減少，在棉籽殼的添加量在50%時，產(chǎn)量有最大值。當(dāng)油茶殼添加量較少且固定時，海鮮菇產(chǎn)量隨著棉籽殼添加量增加而減少，隨著混合料添加量增加而增加。這可能是因為油茶殼發(fā)酵后致密性增強(qiáng)導(dǎo)致海鮮菇在出菇階段營養(yǎng)吸收不足，從而導(dǎo)致海鮮菇產(chǎn)量下降。由統(tǒng)計軟件預(yù)測得出，以海鮮菇子實(shí)體產(chǎn)量為評價指標(biāo)，最佳栽培料的生產(chǎn)配方為：油茶殼添加量0、棉籽殼添加量50%、混合料添加量50%，預(yù)計最高產(chǎn)量約為247.3 g。

2.2.3 不同配方對海鮮菇子實(shí)體的農(nóng)藝性狀回歸分析結(jié)果 根據(jù)所得到的試驗結(jié)果，對海鮮菇子實(shí)體農(nóng)藝性狀的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合。根據(jù)擬合結(jié)果可知，該模型擬合具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1)，對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程如下：y=4.650A-0.089B+2.044C-42.326AB+22.173AC+15.849BC+167.312ABC。從表6中可以看出模型P值<0.000 1，達(dá)顯著水平，其決定系數(shù)R2=0.989 5>0.7，說明98.95%的試驗數(shù)據(jù)可以用該模型解釋，表明模型擬合效果較好。

表6 子實(shí)體農(nóng)藝性狀回歸分析結(jié)果

由圖4可知，當(dāng)混合料添加量固定且較大時，海鮮菇子實(shí)體農(nóng)藝性狀評分隨著棉籽殼添加量增加先提高，當(dāng)棉籽殼添加量35.5%時，海鮮菇農(nóng)藝性狀評分有最大值，之后隨著棉籽殼添加量增大而降低，隨著油茶殼添加量增大而提高，直到油茶殼添加量為15.6%時達(dá)到最大值，之后隨著油茶殼添加量增大而降低。這可能是因為油茶殼致密性高導(dǎo)致海鮮菇在出菇階段營養(yǎng)吸收不足，從而導(dǎo)致農(nóng)藝性狀評分下降。以海鮮菇子實(shí)體農(nóng)藝性狀為評價指標(biāo)，最佳栽培料的生產(chǎn)配方：油茶殼添加量15.6%、棉籽殼添加量35.5%、混合料添加量48.9%，預(yù)計子實(shí)體農(nóng)藝性狀得分最高值為9.9分。

2.3 傳統(tǒng)生產(chǎn)配方的海鮮菇品質(zhì)

采用傳統(tǒng)工廠生產(chǎn)配方(棉籽殼添加量65%、混合料添加量35%)，按上述相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測定，得出其生長周期為130 d，產(chǎn)量205 g，農(nóng)藝性狀評分為8.6分。

2.4 工廠化生產(chǎn)配方的設(shè)計

為滿足工廠化生產(chǎn)的需要，必須結(jié)合實(shí)際來設(shè)計最佳配方，須要考慮以下幾點(diǎn)因素：海鮮菇栽培周期時間不能太長，否則會直接加大海鮮菇成本；海鮮菇產(chǎn)量不能太低，否則直接會加大海鮮菇成本；子實(shí)體農(nóng)藝性狀不能太差，否則會導(dǎo)致海鮮菇將難以銷售。

根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)經(jīng)驗，設(shè)定海鮮菇栽培周期的范圍在 110～131 d、海鮮菇產(chǎn)量范圍在200～251 g、子實(shí)體農(nóng)藝性狀評分范圍在8.6～9.4分，采用統(tǒng)計軟件Design-Expert 8.0.6 進(jìn)行模型分析，得到最適合工廠化的配方為：油茶殼添加量21.8%、棉籽殼添加量42.8%、混合料添加量35.4%。通過采用統(tǒng)計軟件Design-Expert 8.0.6預(yù)測該配方栽培周期為115 d、產(chǎn)量為216.4 g、子實(shí)體農(nóng)藝性狀評分為8.9分。并對該配方進(jìn)行驗證試驗，結(jié)果顯示，海鮮菇生長周期為 115 d、產(chǎn)量217.1 g、農(nóng)藝性狀為8.8分。與傳統(tǒng)未加油茶殼的配方(棉籽殼添加量65%，混合料添加量35%)相比，該配方的生產(chǎn)周期縮短了15 d、產(chǎn)量增加了11.4 g。

2.5 優(yōu)化配方和傳統(tǒng)配方海鮮菇子實(shí)體營養(yǎng)品質(zhì)的比較

由表7可知，采用優(yōu)化后的配方瓶栽的海鮮菇的灰分、粗蛋白質(zhì)及粗纖維含量均顯著高于傳統(tǒng)配方瓶栽的海鮮菇，這可能是油茶殼經(jīng)過發(fā)酵以后，其微量元素、氮、有機(jī)質(zhì)含量增加，導(dǎo)致優(yōu)化后配方的海鮮菇灰分、蛋白及纖維較高。但2種海鮮菇的水分及粗脂肪含量均無顯著的差異，同時其子實(shí)體的水分低于91%，有利于海鮮菇的貯藏。采用優(yōu)化后的配方瓶栽海鮮菇，含水量不僅保持在90%左右，而且脂肪含量低、蛋白質(zhì)、纖維素含量高，滿足人們對營養(yǎng)和健康的要求。

表7 優(yōu)化配方和傳統(tǒng)配方海鮮菇子實(shí)體營養(yǎng)品質(zhì)的比較

3 結(jié)論

采用混料設(shè)計方法[17]，以油茶殼、棉籽殼、混合料(木屑、麥麩、玉米粉)為主要原料，設(shè)計16組配方進(jìn)行栽培試驗，通過對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，建立了栽培周期、產(chǎn)量、子實(shí)體農(nóng)藝性狀與響應(yīng)值的回歸方程，分別為：y周期=48.882A+88.702B+10.478C-61.824AB+394.419AC+228.249BC；y產(chǎn)量=91.876A+119.713B+173.053C+214.987AB+459.389AC；y農(nóng)藝性狀=4.650A-0.089B+2.044C-42.326AB+22.173AC+15.849BC+167.312ABC。對回歸方程進(jìn)行方差分析，這3個回歸方程的決定系數(shù)都大于0.7，結(jié)果表明這3個回歸方程模型擬合性較好。

從不同配方對栽培周期的影響結(jié)果進(jìn)行分析，當(dāng)以海鮮菇子實(shí)體栽培周期為評價指標(biāo)時，最佳栽培料的生產(chǎn)配方為：油茶殼添加量50%、棉籽殼添加量0、混合料添加量50%，并預(yù)計最短栽培周期為107 d；以海鮮菇子實(shí)體產(chǎn)量為評價指標(biāo)，最佳栽培料的生產(chǎn)配方為：油茶殼添加量0、棉籽殼添加量50%、混合料添加量50%，并預(yù)計最高產(chǎn)量為247.3 g；以海鮮菇子實(shí)體農(nóng)藝性狀為評價指標(biāo)，最佳栽培料的生產(chǎn)配方：棉籽殼添加量35.5%、油茶殼添加量15.6%、混合料添加量48.9%，預(yù)計子實(shí)體農(nóng)藝性狀最高的評分值為9.9分。

工廠化生產(chǎn)海鮮菇需要栽培周期短、產(chǎn)量高以及子實(shí)體農(nóng)藝性狀好的生產(chǎn)配方，通過優(yōu)化計算得到適合工業(yè)化生產(chǎn)的配方：油茶殼添加量21.8%、棉籽殼添加量42.8%、混合料添加量35.4%，與傳統(tǒng)配方相比，該配方具有栽培周期短、產(chǎn)量高的優(yōu)勢，同時灰分、粗蛋白質(zhì)及粗纖維含量高。