何靜雯，李 晨，邱 甜，吳燕燕，沈梓力，吳月燕

(1.浙江萬(wàn)里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100；2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

葡萄(Vitisvinifera)為多年生木質(zhì)藤本植物，是世界上種植最廣泛的果樹(shù)樹(shù)種之一[1]。而鄞紅葡萄為寧波地區(qū)設(shè)施栽培特有品種，由優(yōu)良變異單株選育而來(lái)，屬歐美雜交種[2-3]。該葡萄品種的栽培主要采用簡(jiǎn)易型日光溫室，可抵御環(huán)境污染和臺(tái)風(fēng)等。但由于設(shè)施條件的限制和季節(jié)性不良?xì)夂虻挠绊懀瑴厥噎h(huán)境通常具有透光量低、透光分布不均、光質(zhì)差、紫外線含量低等缺點(diǎn)，會(huì)造成溫室內(nèi)部分葡萄采光不足。光照不足會(huì)嚴(yán)重影響葡萄生理生化過(guò)程及形態(tài)建成，導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降[4]。植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中會(huì)形成一系列的自我保護(hù)機(jī)制，以抵御脅迫環(huán)境的傷害[5]，弱光環(huán)境下植株生長(zhǎng)受阻、但會(huì)通過(guò)葉面積增加來(lái)抵御弱光脅迫[6]。另外，植物細(xì)胞保護(hù)酶活性的高低以及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成狀況更是植物對(duì)脅迫環(huán)境響應(yīng)的重要指標(biāo)[7]。通常植物細(xì)胞內(nèi)的超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)會(huì)在一定的脅迫程度內(nèi)升高，丙二醛(MDA)、脯氨酸(PRO)含量也會(huì)對(duì)脅迫環(huán)境顯著響應(yīng)[8-9]。近年來(lái)，植物抗逆基因的研究也成為眾多植物領(lǐng)域的熱門(mén)，MYC2轉(zhuǎn)錄因子(MYC2 BHLH protein)與h型硫氧還原蛋白(Thioredoxin h-type)在脅迫環(huán)境下反應(yīng)活躍，能夠調(diào)節(jié)許多相關(guān)因子以抵御脅迫環(huán)境[10-11]。由此可見(jiàn)，弱光響應(yīng)的理化分析與相關(guān)基因表達(dá)量的測(cè)定是植物弱光脅迫研究的關(guān)鍵。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)弱光的研究多是從弱光脅迫對(duì)植物的生理生化、光合作用、同化力的形成等方面入手，且主要集中在辣椒、番茄、茄子等蔬菜作物上[12-13]，對(duì)葡萄生理生化以及相關(guān)基因的研究相對(duì)較少。

本研究以鄞紅葡萄幼苗為材料，研究了其在不同遮陰程度下的生長(zhǎng)形態(tài)變化、細(xì)胞保護(hù)酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以及MYC2與TRX基因相對(duì)表達(dá)量，以闡釋鄞紅葡萄對(duì)弱光脅迫產(chǎn)生響應(yīng)的機(jī)制，旨在為今后葡萄相關(guān)品種的光照管理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試品種為150株長(zhǎng)勢(shì)均勻的1年生鄞紅幼苗。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

溫度恒定在38 ℃，相對(duì)濕度65%。瓦盆高 28.5 cm, 內(nèi)徑 25 cm，人工基質(zhì)培養(yǎng)?；A(chǔ)營(yíng)養(yǎng)成分為有機(jī)質(zhì)5 530 mg/kg、水解氮 43.6 mg/kg、速效磷 11.5 mg/kg、速效鉀93.7 mg/kg。定植前施入復(fù)合肥(N∶P∶K =15∶11∶9)，主梢長(zhǎng)至50 cm時(shí)摘心，副梢留2葉摘心。以遮陽(yáng)網(wǎng)和塑料薄膜為覆蓋材料進(jìn)行遮陰處理，遮陰程度設(shè)置5個(gè)水平,即 CK(遮光率為0、光照強(qiáng)度28 000 lx)、T1(遮光率25%、光照強(qiáng)度約22 000 lx)、T2(遮光率40%、光照強(qiáng)度約17 000 lx)、T3(遮光率70%、光照強(qiáng)度約10 000 lx)、T4(遮光率85%、光照強(qiáng)度約5 000 lx)。在遮陰處理后的0，10，20，30 d觀察并采樣，進(jìn)行各種理化指標(biāo)的測(cè)定，每組指標(biāo)均重復(fù)3次并取平均值。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 鄞紅葉片生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定 每處理組隨機(jī)選取5株，將根部和葉片完整剪下，采用LA-S全能植物圖像分析系統(tǒng)(廣州深華公司)測(cè)定根系長(zhǎng)度、直徑、表面積、葉面積。

1.3.2 鄞紅葉片保護(hù)酶及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的測(cè)定 可溶性蛋白測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[14]；丙二醛測(cè)定采用硫代巴比妥法[15]；脯氨酸測(cè)定采用茚三酮顯色法[16]；超氧化物歧化酶測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(NBT)法[15]；過(guò)氧化氫酶測(cè)定采用紫外吸收法[17-18]；過(guò)氧化物酶測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚比色法[19]。

1.3.3 弱光脅迫下鄞紅相關(guān)基因表達(dá)量測(cè)定 遮陰處理30 d后，測(cè)定葡萄葉片在不同遮陰程度下MYC2與TRX基因表達(dá)量的變化。按照植物總RNA提取試劑盒(OMEGA公司，R6827-01)說(shuō)明書(shū)提取葉片總RNA。采用NanoDropTM 2000分光光度計(jì)(Thermo Fisher, USA)測(cè)定總RNA的質(zhì)量和純度，1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。吸光度OD260/280值在1.9～2.1、電泳有3條亮帶,且28S條帶亮度大約是18S 的2倍,其總RNA為高質(zhì)量RNA，可進(jìn)行cDNA第1鏈合成試驗(yàn)。以提取的高質(zhì)量總RNA為模板，使用SuperRT cDNA第1鏈合成試劑盒(SuperRT cDNA Kit CW0741, CWBIO，China)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，具體操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

根據(jù)已報(bào)道的葡萄MYC2 (NC_012021.3)和TRX(NW_003724430.1)基因序列，采用Primer軟件分別設(shè)計(jì)熒光PCR引物(表1)。數(shù)據(jù)處理采用相對(duì)值2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算，采用GraphPrism 7.0軟件處理數(shù)據(jù)和作圖，采用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，用LSD法進(jìn)行多重比較。

表1 熒光定量PCR基因擴(kuò)增引物序列Tab.1 Primer sequences used for Q-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 弱光脅迫對(duì)鄞紅葉片生長(zhǎng)特性的影響

試驗(yàn)過(guò)程中與CK相比，T1葉片生長(zhǎng)狀況良好，T2葉片生長(zhǎng)狀況一般，T3生長(zhǎng)狀況下降明顯，葉片出現(xiàn)一定的黃斑和脫落現(xiàn)象，與對(duì)照組相比差異顯著,但仍然能夠繼續(xù)生長(zhǎng)。其中，弱光環(huán)境下，T2的葉面積會(huì)隨著弱光脅迫的增加而變大，與對(duì)照組相比差異顯著(表2)。但隨著遮陰程度的進(jìn)一步加強(qiáng)，T4葉片出現(xiàn)大量黃斑和脫落，生長(zhǎng)嚴(yán)重受阻，各項(xiàng)指標(biāo)均低于對(duì)照組。因此，一定程度的遮陰有利于葉片生長(zhǎng)，但遮陰過(guò)強(qiáng)會(huì)對(duì)植株造成不可恢復(fù)的傷害。

表2 弱光脅迫對(duì)鄞紅葉片生長(zhǎng)特性的影響Tab.2 Effects of low light stress on the growth characteristics of Yinhong grape

注：不同字母代表差異顯著(P<0.05)。圖1-4同。

Note: The different letters indicate significant difference(P<0.05).The same as Fig.1-4.

2.2 弱光脅迫對(duì)鄞紅葡萄葉片可溶性蛋白含量的影響

弱光脅迫下，T1與T2可溶性蛋白質(zhì)含量的變化趨勢(shì)與CK相似，均略微升高后維持穩(wěn)定(圖1)，在30 d處理結(jié)束后分別比對(duì)照上升 2.5%和5.7%，與CK相比差異不顯著(P>0.05)。但隨著遮陰程度的增加，在T3與T4組中，葉片可溶性蛋白含量隨遮陰時(shí)間增長(zhǎng)呈逐漸下降的趨勢(shì)，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)分別下降22.7% 和 36.1%，均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

圖1 弱光脅迫對(duì)鄞紅葡萄葉片可溶性蛋白質(zhì)含量的影響Fig.1 Effects of low light stress on the soluble protein content in Yinhong grape leaves

2.3 弱光脅迫對(duì)鄞紅葡萄葉片丙二醛和脯氨酸含量的影響

遮陰結(jié)束后各處理組丙二醛、脯氨酸含量變化呈逐漸上升趨勢(shì)(圖2)，其中丙二醛含量依次逐漸上升，從T1～T4相比CK分別上升了23.5%，34.8%，52.8%，98.5%，處理組與對(duì)照組相比除T1處理外差異顯著(P<0.05)。脯氨酸的含量也隨遮陰程度的增加而逐漸升高，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)T1～T4分別比CK上升了27.1%，35.5%，63.6%，95.2%，處理組與對(duì)照組相比差異均顯著(P<0.05)。

2.4 弱光脅迫對(duì)鄞紅葡萄葉片保護(hù)酶活性的影響

隨著遮陰程度的增強(qiáng)，葉片中SOD、POD、CAT活性均呈先升高后降低的趨勢(shì)(圖3)。但在遮陰處理結(jié)束時(shí)，鄞紅葉片T1與T2組中SOD、POD、CAT含量相比CK分別下降 5.4%，4.8%，2.7% 和 17.1%，9.1%，3.9%，但差異不顯著(P>0.05)；但隨著遮陰程度的增加，T3與T4組葉片保護(hù)酶活性呈持續(xù)降低狀態(tài)，在處理結(jié)束時(shí)SOD、POD、CAT分別比CK下降了27.0%，30.5%，22.3% 和 52.8%，49.9%，48.7%，均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

圖2 弱光脅迫對(duì)鄞紅葡萄葉片中丙二醛和脯氨酸含量的影響Fig.2 Effects of low light stress on the MDA content and proline content in Yinhong grape leaves

圖3 弱光脅迫對(duì)鄞紅葡萄葉片保護(hù)酶活性的影響Fig.3 Effects of low light stress on the protective enzyme activities in Yinhong grape leaves

2.5 MYC2與TRX基因表達(dá)量分析

30 d處理結(jié)束時(shí)，對(duì)鄞紅葡萄葉片MYC2與TRX基因表達(dá)量的測(cè)定發(fā)現(xiàn)(圖4)，與CK相比MYC2與TRX基因的表達(dá)量均先升高后降低，這與CAT和可溶性蛋白的變化趨勢(shì)大致相當(dāng)。在T1處理下MYC2與TRX基因表達(dá)量顯著上升，由此證明適度遮陰會(huì)通過(guò)二者上調(diào)表達(dá)來(lái)抵御脅迫環(huán)境，但隨著遮陰程度的增強(qiáng)表達(dá)量又顯著降低(P<0.05)，重度弱光脅迫已經(jīng)超出了抗逆體系的承受范圍。

圖4 弱光脅迫下MYC2與TRX基因表達(dá)量的變化Fig.4 Relative expression of MYC2 and TRX under low light stress

3 結(jié)論與討論

光是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的重要因子，通常弱光處理下的植株根系受阻[2]，同時(shí)會(huì)出現(xiàn)葉片變薄、葉色變淺、葉面積增加等現(xiàn)象[13]。唐韡等[20]研究發(fā)現(xiàn)，弱光脅迫下番茄根系活力下降。蔣曉婷等[21]對(duì)絲瓜研究發(fā)現(xiàn)，遮陰處理使植株根冠比顯著下降、同化產(chǎn)物積累減少，植株干質(zhì)量降低。丘立杭等[22]對(duì)甘薯的研究表明，弱光脅迫顯著抑制甘蔗莖粗，使莖徑不斷減小。易金鑫等[7]研究發(fā)現(xiàn),弱光脅迫下茄子葉面積增加，生長(zhǎng)受阻。本研究中，鄞紅葡萄在T1處理下生長(zhǎng)狀況良好，對(duì)弱光環(huán)境抗性較高，植株通過(guò)增加葉面積捕獲更多光能制造有機(jī)物。但隨著遮陰程度的增強(qiáng)，植株各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)降低，發(fā)育減緩，這與常靜等[8]對(duì)辣椒的研究結(jié)論大致相符。

弱光脅迫下葡萄葉片內(nèi)可溶性蛋白、脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)均會(huì)發(fā)生變化。一定脅迫程度下植物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成受阻，但植物也會(huì)通過(guò)增加蛋白質(zhì)的含量以適應(yīng)脅迫環(huán)境[22]。脯氨酸作為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，在脅迫環(huán)境下降低植物細(xì)胞水勢(shì)、調(diào)節(jié)細(xì)胞微環(huán)境、提高胞內(nèi)代謝反應(yīng)[23-24]。候永平等[25]研究發(fā)現(xiàn)，低溫弱光處理西葫蘆后可溶性蛋白含量顯著降低，這與遲偉等[26]對(duì)草莓的研究結(jié)果一致。本研究中,鄞紅葡萄葉片可溶性蛋白先升高后降低，由此證明該品種對(duì)弱光具有一定的適應(yīng)性；而脯氨酸含量隨遮陰程度的增強(qiáng)逐級(jí)遞增，以此表明葉片的受害程度不斷增強(qiáng)，這與陳磊等[27-28]對(duì)于茄子的研究結(jié)果大致相當(dāng)。

MDA是判斷植物細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度的重要指標(biāo)，脅迫環(huán)境會(huì)使MDA大量積累,從而導(dǎo)致細(xì)胞受損[29]，而SOD、POD 和 CAT 等酶是細(xì)胞內(nèi)清除活性氧和自由基的主要保護(hù)酶，這些酶與植物的抗逆系統(tǒng)密切相關(guān)[30]。其中,SOD會(huì)抵御逆境脅迫下植株內(nèi)超氧陰離子的增加，POD與CAT參與多種抗氧化代謝，有控制植株生長(zhǎng)以及分解 H2O2等作用，使植物細(xì)胞免受毒害[31]。任華中等[32]在番茄的研究中表明，細(xì)胞保護(hù)酶活性隨光照強(qiáng)度的減弱而升高。劉永華等[33]對(duì)瓠瓜遮陰處理后研究發(fā)現(xiàn)，MDA與抗氧化酶活性與光照強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)。本研究中，MDA 含量隨脅迫程度的增加而升高，SOD、POD 和 CAT 活性先升高后降低；但POD 變化趨勢(shì)沒(méi)有SOD 和CAT 明顯，這可能是由于 POD 既參與自由基的消除，同時(shí)也參與活性氧的生成[34-35]。因此，適度弱光脅迫會(huì)激活植物體內(nèi)抗逆系統(tǒng)，促使保護(hù)酶活性上升；但重度脅迫會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞受損，從而無(wú)法合成細(xì)胞保護(hù)酶，此試驗(yàn)結(jié)果與宋金亮等[36]對(duì)西葫蘆的研究結(jié)果一致。

MYC 2轉(zhuǎn)錄因子與硫氧還蛋白(TRX)都與脅迫環(huán)境密切相關(guān)。其中MYC 2轉(zhuǎn)錄因子是植物 bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，該轉(zhuǎn)錄因子是茉莉酸(JA)信號(hào)途徑中的核心因子，在生物或非生物脅迫下通過(guò)激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性來(lái)抵御逆境脅迫[37]。Sasaki-Sekimoto等[38]研究發(fā)現(xiàn)，JA能夠誘導(dǎo)擬南芥抗壞血酸合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，證明MYC 2轉(zhuǎn)錄因子在植物細(xì)胞抗氧化中正調(diào)控。Yadav等[39]研究表明，擬南芥MYC 2轉(zhuǎn)錄因子能結(jié)合Z-box與G-box光應(yīng)答結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)光調(diào)控基因的表達(dá)。Gangappa等[10]驗(yàn)證了雙突變擬南芥中MYC 2能結(jié)合SPA1 (SUPPRESSOR OF PHYTOCHROME1)啟動(dòng)子抑制光形態(tài)建成。硫氧還蛋白(TRX)是一種在植物體高度保守的低分子量酸性蛋白，能夠清除細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species, ROS)，從而對(duì)抗逆基因進(jìn)行代謝調(diào)控[11]。 Laloi等[40]研究發(fā)現(xiàn)，TRX h過(guò)表達(dá)會(huì)促進(jìn)擬南芥CAT的活性升高，以抵御逆境脅迫。Broin等[41]研究表明，與TRX活性中心類(lèi)似的CDSP32是植物抵御光合作用膜脂過(guò)氧化過(guò)程的重要組成部分。另外，TRX h還通過(guò)二硫鍵的氧化還原反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其變性[42-43]。通過(guò)對(duì)MYC2和TRX在鄞紅葡萄中基因表達(dá)量測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，隨著弱光脅迫程度的加強(qiáng)，二者表達(dá)量均先升高后降低，與抗氧化酶活性的研究結(jié)果大致相同。這可能是因?yàn)橹仓暝谶m度弱光下，通過(guò)MYC2和TRX表達(dá)上調(diào)來(lái)清理體內(nèi)多余的ROS；其中，TRX h與可溶性蛋白的變化也基本一致，進(jìn)一步證明了植物在脅迫環(huán)境下會(huì)通過(guò)合成與分解可溶性蛋白減少細(xì)胞受損。但高度弱光脅迫下細(xì)胞受損會(huì)導(dǎo)致基因調(diào)控失衡，這與前人對(duì)擬南芥的研究結(jié)果基本一致[38]。

由于寧波地區(qū)夏季光照充足、溫度恒定，本研究證明適度遮陰較有利于鄞紅葡萄的生長(zhǎng)，適度弱光下細(xì)胞保護(hù)酶活性與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成狀況良好。今后需驗(yàn)證更多與鄞紅有關(guān)的應(yīng)答基因，以確認(rèn)該基因是否受到弱光脅迫的進(jìn)一步誘導(dǎo)。另外，在弱光脅迫的基礎(chǔ)上，可以加入高溫、高濕、重金屬脅迫等雙重或多重脅迫因子，結(jié)果可為多抗葡萄品種的選育提供理論支持。