李帆

（安慶醫(yī)藥高等?？茖W校，安徽安慶 246052）

在高校微生物實驗教學中，菌種污染是一個普遍存在的現象，一直困擾著教師和科研工作者，嚴重影響了教學效果。選擇含有抗菌藥物的培養(yǎng)基可以有效地抑制雜菌的生長[1]。荷葉堿（Nuciferine，NF）系從荷葉中提取的一種阿樸啡類生物堿，其為荷葉的主要活性成分之一，Li[2]等通過實驗發(fā)現，荷葉堿能夠顯著抑制細菌和酵母菌的繁殖和增長，對霉菌的抑制作用較弱，這主要是因為荷葉堿抑制了酵母和細菌的有絲分裂，但霉菌除了進行無性繁殖外還進行有性繁殖，因此對其生長繁殖的抑制作用不明顯。故本實驗通過藥敏試驗檢驗不同濃度的荷葉堿營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基對青霉菌和實驗室環(huán)境細菌的抑菌效果，為制備具有抑菌效果的青霉菌培養(yǎng)基提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

青霉菌由合肥師范學院微生物實驗室分離保存；大腸桿菌由本實驗室從土壤中分離保存；枯草芽胞桿菌（ATCC6633，南京便診生物科技有限公司）；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（杭州微生物試劑有限公司）；哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基（上?？卢敿紊锟萍加邢薰荆?；荷葉堿（分析純，上海源葉生物科技有限公司）；定性濾紙（中速，泰州市濾紙廠）；電熱恒溫培養(yǎng)箱DNP型（上海精宏實驗設備有限公司）；高壓蒸汽滅菌器YX-280D+（合肥市華泰醫(yī)療設備有限公司）；紫外燈2537A型（江蘇申星光電醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分離、純化、鑒定污染青霉菌培養(yǎng)基的細菌

青霉菌培養(yǎng)過程中可能污染培養(yǎng)基的細菌主要來源于實驗室教學用的其他菌種和實驗室環(huán)境雜菌。其中，實驗室環(huán)境雜菌主要來源于空氣、實驗人員包括教師和學生的手指皮膚以及實驗室桌面；而本實驗室教學用菌種主要有青霉菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌。實驗室環(huán)境雜菌的標本采集方法如下：采用空氣沉降法收集實驗室空氣標本；隨機采集安慶醫(yī)藥高等?？茖W校護理、藥學、臨床3個不同專業(yè)10個班級20名同學和所有授課教師共6名的手指皮膚樣本，接種于血平板；實驗桌面標本采用無菌棉拭子法。所有標本置37 ℃恒溫箱中培育24 h，選擇優(yōu)勢菌株經形態(tài)結構、16S rDNA鑒定確定其分類地位。

1.2.2 藥敏試驗

（1）荷葉堿抗菌藥紙片制作。將定性濾紙用打孔機打成6 mm直徑的圓形小紙片50片，分裝在2支清潔干燥的小試管中，高壓蒸汽滅菌后，置于恒溫培養(yǎng)箱中45 ℃干燥。在小試管內加入濃度為7 U/L荷葉堿藥液0.25 mL，小心翻動紙片，使各紙片充分浸透藥液。同時在瓶口上記錄藥物名稱，放恒溫培養(yǎng)箱中45 ℃干燥后即密蓋，置冰箱冷凍室存放備用，有效期6個月。（注：1U（萬單位）=10mg）

（2）藥敏試驗（紙片法）。將青霉菌、大腸桿菌、枯草芽胞桿菌和實驗室環(huán)境雜菌密集劃線法接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，將自制荷葉堿抗菌藥物紙片貼于平板中央，青霉菌28 ℃培養(yǎng)48 h，細菌37 ℃培養(yǎng)24 h后，記錄抑菌圈直徑，檢測其對荷葉堿的藥物敏感度。

1.2.3 荷葉堿抑菌濃度

配制每升含1 U、3 U、5 U、7 U、9 U、11 U、13 U、15 U、17 U、19 U和21 U不同濃度荷葉堿的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，制成平板。將青霉菌和可能污染青霉菌培養(yǎng)基的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和實驗室環(huán)境雜菌分別接種于平板上，青霉菌28 ℃培養(yǎng)48 h，細菌37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察記錄生長情況。根據結果分析青霉菌耐藥，細菌敏感的最低荷葉堿濃度。

2 結果與分析

2.1 實驗室環(huán)境菌種鑒定

空氣、手指皮膚和實驗桌面標本經37 ℃恒溫箱中培育24 h后，得到3株優(yōu)勢菌株，分別命名為B1、B2、B3。（1）菌落形態(tài)（圖1）。B1：白色、圓形凸起、邊緣整齊、表面光滑、濕潤、不透明的菌落；B2：白色、圓形凸起、邊緣整齊、表面粗糙、濕潤、不透明的菌落，有草綠色溶血環(huán)；B3：白色、圓形凸起、邊緣整齊、表面光滑、濕潤、不透明的菌落，有透明溶血環(huán)。（2）革蘭染色（圖2）。B1是G+球菌，B2是G+桿菌，B3是G+球菌。經16S rDNA鑒定確定其分類地位，見表1。由于本實驗室教學常用的菌種為青霉菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌，因此，實驗教學中可能污染青霉菌菌種的雜菌主要5種，分別是大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、科氏/孔氏葡萄球菌、高地芽孢桿菌和表皮葡萄球菌。

圖1 實驗室環(huán)境菌種菌落形態(tài)

圖2 實驗室環(huán)境菌種革蘭染色

2.2 藥敏試驗

藥敏試驗的結果（表2）表明，青霉菌對荷葉堿耐藥，大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、科氏/孔氏葡萄球菌、高地芽孢桿菌和表皮葡萄球菌均對荷葉堿敏感。荷葉堿可制成藥品[3]，充分發(fā)揮其殺毒、滅菌、降血壓、止痙攣等作用。因此，可將荷葉堿作為本實驗室青霉菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的抑菌藥物。

2.3 荷葉堿最低抑菌濃度

將青霉菌、大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、科氏/孔氏葡萄球菌、高地芽孢桿菌和表皮葡萄球菌分別接種于不同濃度荷葉堿的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，青霉菌28 ℃培養(yǎng)48 h，細菌37 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察生長情況，結果見表3。由表3可知，培養(yǎng)基中荷葉堿濃度為1～21 U/L時，青霉菌均能生長良好，說明荷葉堿對青霉菌沒有抑菌效果；培養(yǎng)基中荷葉堿濃度高于7 U/L時大腸桿菌不能生長；荷葉堿濃度高于13 U/L時枯草芽孢桿菌不能生長；荷葉堿濃度高于9 U/L時科氏/孔氏葡萄球菌不能生長；荷葉堿濃度高于7 U/L時高地芽孢桿菌不能生長；荷葉堿濃度高于11 U/L時表皮葡萄球菌不能生長。因此，培養(yǎng)基中荷葉堿濃度高于為13 U/L時大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、科氏/孔氏葡萄球菌、高地芽孢桿菌和表皮葡萄球菌均不能生長，而青霉菌生長良好，青霉菌培養(yǎng)基中荷葉堿最低抑菌濃度是13 U/L。

表1 實驗室環(huán)境優(yōu)勢菌種鑒定結果

表2 藥敏試驗結果

表3 不同濃度的荷葉堿培養(yǎng)基中菌種生長情況

3 結論

本研究通過藥敏試驗結果證明，用濃度為13 U/L的荷葉堿營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)青霉菌，能夠有效抑制大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、科氏/孔氏葡萄球菌、高地芽孢桿菌和表皮葡萄球菌生長。我國的荷葉資源豐富[4]，價格低廉且易得，故對荷葉堿在培養(yǎng)基中的抑菌效果研究具有很大的現實意義。