不同方法誘導(dǎo)的γδT細胞體外抗肺癌作用比較

趙鑫 常穎 劉玉俠 王寶 盧衛(wèi)平 王啟文

(1吉林省腫瘤醫(yī)院 ，吉林 長春 130012；2吉林省腫瘤防治研究所)

肺癌在我國已經(jīng)成為常見的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率居高不下，其常規(guī)治療方法有手術(shù)、化療、放療等，但治療后有許多病人會出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，其原因與化療、放療后機體的免疫功能下降有關(guān)。針對這一現(xiàn)狀，對放化療后患者提高免疫力進行預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)就顯得尤為重要。如何提高免疫力，預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，目前的研究已經(jīng)證明樹突細胞(DCs)、細胞因子活化的殺傷細胞(CIK)、自然殺傷細胞(NKs)、γδT細胞等免疫細胞對提高機體的免疫功能發(fā)揮著重要作用。而近年來的研究證實，γδT細胞在抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮著獨特的作用。眾所周知，體內(nèi)起主要作用的抗腫瘤細胞是T淋巴細胞。T細胞根據(jù)表面抗原受體(TCR)的不同分為αβT細胞及γδT細胞。在機體內(nèi)，αβT細胞主要通過主要組織相溶性抗原(MHC)限制性識別腫瘤細胞，參與獲得性免疫，使其應(yīng)用受限。而γδT細胞是一種介于獲得性免疫與天然免疫之間的細胞，其功能不受MHC限制，不依賴于抗原的處理和遞呈過程，所以近年來對其研究較多。本實驗通過用抗人TCR γ/δ聯(lián)合白細胞介素(IL)-2及唑來膦酸聯(lián)合IL-2兩種方法進行γδT的體外誘導(dǎo)擴增，并對肺癌細胞A549進行體外殺傷實驗，為γδT細胞的研究和用于肺癌的治療提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料 IMDM細胞培養(yǎng)基：美國Gibco公司， 噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)：美國Sigma公司，胎牛血清：Hyclone公司；IL-2：北京遠策藥業(yè)有限責任公司；淋巴細胞分離液：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程醫(yī)學(xué)研究所；唑來膦酸：深圳海王藥業(yè)有限公司；抗人TCRγ/δ，PE標記的抗人TCRγ/δ克隆B1:Biolegend公司。 生物倒置顯微鏡(Olympus)：日本；低溫低速離心機(SORVALL RTT)：美國；全自動酶標儀：Labsystems Dragon；超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備廠；HERA CEEL 240iCO2培養(yǎng)箱，Thermo Scientific公司；流式細胞儀，BD公司。肺癌細胞A549：購于上海生物細胞研究所。

1.2方法

1.2.1人外周血γδT細胞的體外誘導(dǎo)、培養(yǎng)、鑒定 抽取健康志愿者外周血，用淋巴細胞分離液分離人外周血淋巴細胞，計細胞數(shù)為1×106/ml,加至100 ml細胞培養(yǎng)瓶，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中飽和濕度下培養(yǎng)。誘導(dǎo)方法1：取1瓶以上分離的細胞，加入抗人TCRγ/δ 0.4 μg/ml,IL-2 300 IU/ml,放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，每3天半量補加抗人TCRγ/δ、IL-2等細胞因子并換液，培養(yǎng)至第6天時，用流式細胞儀對培養(yǎng)的細胞進行γ/δT細胞表型鑒定及殺傷活性實驗。誘導(dǎo)方法2：另取1瓶分離的細胞，加入唑來膦酸10 μmol/L,IL-2 500 IU/ml,培養(yǎng)方法同1。取以上抗人TCRγ/δ加IL-2及唑來膦酸加IL-2的細胞進行γ/δT細胞表型鑒定。方法：分別取以上培養(yǎng)的細胞，調(diào)細胞數(shù)為(5～10)×105/100 μl ，加PE抗人TCRγ/δ 20 μl，冰上孵育15 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，最后加PBS 500 μl，混勻，上流式細胞儀進行檢測。

1.2.2γδT殺傷實驗(MTT法) 接種腫瘤細胞。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的A549細胞接種到96孔細胞培養(yǎng)板，100 μl/孔。將經(jīng)過兩種方法培養(yǎng)鑒定的γδT細胞調(diào)細胞數(shù)為2.5×106/ml,按以下設(shè)計加入到已經(jīng)接種了A549的96孔細胞培養(yǎng)板中，100 μl/孔，每個樣品設(shè)6復(fù)孔。第1組：抗人TCRγ/δ +IL-2，第2組：抗人TCRγ/δ +IL-2+A 549，第3組：唑來膦酸+IL-2，第4組：唑來膦酸+IL-2+A549，第5組：A549。以上細胞培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h加MTT(5 mg/ml) 20 μl/孔，培養(yǎng)結(jié)束后，小心吸去上清，每孔加150 μl DMSO，震蕩混勻，在酶標儀492 nm波長處測OD值。殺傷活性計算方法：殺傷活性=(1-實驗組OD值-效應(yīng)細胞OD值)×100%/靶細胞OD值×100%。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

抗人TCRγ/δ聯(lián)合IL-2誘導(dǎo)的γδT細胞表達率為62.10%，對A549的殺傷活性為82.47%；唑來膦酸聯(lián)合IL-2誘導(dǎo)的γδT細胞表達率達61.50%，對A549的殺傷活性為81.09%，兩組細胞表達率及對A549的殺傷活性差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

3 討 論

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率位均居惡性腫瘤之首。雖然肺癌早期通過手術(shù)治療可以取得較好的治療效果，甚至部分患者通過手術(shù)切除后可以達到治愈。但是因為肺癌初期無明顯癥狀，發(fā)現(xiàn)時大多已處于晚期，使其治療效果和預(yù)后較差。在肺癌患者中，非小細胞肺癌(NSCLC)約占肺癌病例總數(shù)的80%〔1〕，NSCLC根據(jù)病理類型可分為肺鱗癌、肺腺癌和大細胞肺癌等，其中肺腺癌占NSCLC的大多數(shù)。對于晚期患者，多數(shù)已不適合手術(shù)，只能采取化療、放療等方法治療，或者是手術(shù)后需要進行化療、放療等后續(xù)治療，但是這些治療會使患者的免疫功能遭受打擊，使免疫功能明顯下降，導(dǎo)致治療不能順利進行，影響效果。

免疫治療作為腫瘤治療的方法之一，目前在腫瘤的治療中發(fā)揮著一定作用。在免疫治療過程中，免疫細胞可以直接參與殺傷腫瘤細胞及通過分泌腫瘤壞死因子(TNF)-α等具有殺傷活性的細胞因子進行抗腫瘤反應(yīng)，還可以通過激活機體免疫系統(tǒng)提高機體免疫力達到主動抗腫瘤的效果，因此在腫瘤的綜合治療中發(fā)揮著重要作用〔2〕。目前已有多種免疫細胞用于惡性腫瘤的治療，在惡性腫瘤的治療中發(fā)揮著重要作用。

眾所周知，T淋巴細胞是主要的抗腫瘤細胞。γδT細胞是近年來發(fā)現(xiàn)的一種功能強大的T淋巴細胞，在機體內(nèi)具有殺傷和調(diào)節(jié)雙重作用〔3〕，同時維護機體的免疫平衡，所以在腫瘤的綜合治療中發(fā)揮著非常重要作用，在抗感染等方面也發(fā)揮著重要作用〔4，5〕。在抗腫瘤過程中，γδT細胞能夠以MHC非限制性地方形式特異性識別腫瘤抗原，作為抗原提呈細胞(APC)起到抗原遞呈作用，特異性殺傷腫瘤細胞，并通過分泌IL-2、TNF-α、γ干擾素(IFN-γ)等細胞因子促進其他免疫細胞的活化〔6〕，對腫瘤細胞直接殺傷。另外，γδT細胞還能與其他多種免疫細胞相互作用，激發(fā)這些細胞發(fā)揮抗腫瘤作用。體外實驗證實，γδT細胞能殺傷多種自體腫瘤細胞或異基因來源的腫瘤細胞系，而不會影響正常細胞的功能〔7～9〕。但是由于γδT細胞在外周血中所占比例較少，只有1%～10%〔10〕，使其研究和應(yīng)用得到限制。如何獲得較多數(shù)量的γδT細胞，對其功能進行深入研究成為首要解決的問題〔11〕。

唑來膦酸是雙磷酸鹽類藥物，臨床上主要用于腫瘤患者如乳腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、肺癌、胃癌等多種實體瘤化療后引起的骨轉(zhuǎn)移和高鈣血癥的治療〔12〕。研究發(fā)現(xiàn)唑來膦酸還能活化人外周血γδT細胞〔13〕，它既能促進γδT細胞的生長，也能抑制腫瘤細胞生長〔14,15〕,而且與其他誘導(dǎo)γδT細胞的化學(xué)試劑相比，其價格要低很多。本實驗根據(jù)其特性，用其聯(lián)合IL-2培養(yǎng)誘導(dǎo)的γδT細胞與用γδT CR聯(lián)合IL-2誘導(dǎo)的γδT細胞進行比較，兩種誘導(dǎo)方法無論是在表達率還是殺傷活性方面沒有明顯差異，為γδT細胞的擴增及應(yīng)用提供了經(jīng)濟實用的方法。