張秀坤,陳小云

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

支原體（Mycoplasma），是介于細(xì)菌和病毒之間的無細(xì)胞壁的原核微生物，高度多形性，能夠通過濾菌器，是目前發(fā)現(xiàn)的能夠在無生命培養(yǎng)基中生長繁殖的最小細(xì)胞性原核微生物，在分類學(xué)上歸屬于柔膜體綱。支原體產(chǎn)生的疾病通常具有敗血癥階段，隨后引起體腔或關(guān)節(jié)的炎癥；或是直接影響呼吸道，最終導(dǎo)致猝死或慢性病，給世界經(jīng)濟造成巨大影響。

山羊傳染性胸膜肺炎（Contagious caprine pleuropneumonia，CCPP）是由山羊支原體山羊肺炎亞種（Mycoplasma capricolumsubsp.capripneumoniae，Mccp）[1]引起的一種高度接觸性呼吸道傳染病，由典型的Mccp引起的山羊呼吸道疾病的主要癥狀包括單側(cè)肝樣胸膜肺炎、黏連、胸膜炎和胸膜積液。本病具有高發(fā)病率和高死亡率的特點，新感染的羊群，發(fā)病率可達(dá)100%，死亡率可達(dá)80%，給山羊養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失，被世界動物衛(wèi)生組織（Office International Des Epizootes，OIE）列為必須報告的疫病。鑒于本病的嚴(yán)重影響，本文從病原學(xué)、分子生物學(xué)、診斷及防治等方面對本病進行詳細(xì)介紹。

1 病原學(xué)

山羊支原體山羊肺炎亞種于1976年在肯尼亞首次分離到，命名為F38株[2]。Mccp屬于絲狀支原體簇，該簇是由柔膜體綱、支原體目、支原體科、支原體屬下五個遺傳學(xué)和血清學(xué)關(guān)系十分相近的支原體組成，簇內(nèi)支原體均能夠感染反芻動物[3]。

Mccp無細(xì)胞壁，有三層細(xì)胞膜包裹，呈多形性。直徑200～500 nm，可通過220μm濾膜。革蘭氏染色陰性，通常使用吉姆薩染色法染色，菌體呈藍(lán)紫色或淡藍(lán)色。Mccp營養(yǎng)要求嚴(yán)格，可用Thiaucourt氏培養(yǎng)基和改良Thiaucourt氏培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，5～7 d長成“煎蛋狀”菌落。對理化因素較敏感，55℃加熱5～15 min即可殺滅。

Mccp為細(xì)胞膜表面寄生菌，不進入細(xì)胞內(nèi)，通常由呼吸道感染，主要通過吸附于宿主細(xì)胞膜表面吸收營養(yǎng)，同時釋放有毒代謝產(chǎn)物使宿主細(xì)胞損傷，也可以通過激活宿主機體的異常免疫反應(yīng)造成組織損傷從而發(fā)揮致病作用。

2 流行病學(xué)

Mccp的原型株為F38株，該病原首次分離自肯尼亞，隨后從蘇丹、突尼斯、阿曼、土耳其、乍得、烏干達(dá)、埃塞俄比亞、尼日利亞、坦桑尼亞、厄立特里亞、阿拉伯聯(lián)合酋長國等國均分離到病原。不斷改進的診斷方法顯示Mccp在亞洲和非洲的一些國家廣泛存在，迄今共有30～40個國家懷疑或已證實Mccp在其領(lǐng)土內(nèi)的存在。目前，已在中國、塔吉克斯坦、毛里求斯等國家檢測到Mccp在亞洲地區(qū)的傳播[4－5]。2004年，歐洲大陸首次報道，在土耳其色雷斯確診，有些羊群死亡率達(dá)25%，證實了其在東土耳其的存在，該研究同時從山羊和綿羊體內(nèi)分離到相似菌株，不但對Mccp的嚴(yán)格宿主特異性產(chǎn)生疑問，同時對周圍國家及所在地區(qū)野生動物來說也是巨大的安全風(fēng)險[6]，因此應(yīng)當(dāng)重視其對無疫區(qū)的流行病學(xué)風(fēng)險，幾乎可以預(yù)見其在未來幾年將在懷疑有病原存在的國家得以證實[7]。

也有研究表明Mccp的存在和傳播與其他疾病的相互關(guān)系，例如肯尼亞[8]、埃塞俄比亞[9－11]、坦桑尼亞[12]等地區(qū)流行的影響小反芻獸的疫病，這些信息可以用來加以分析設(shè)計更有效防控CCPP的控制策略。

CCPP一直被認(rèn)為是僅感染家養(yǎng)山羊群的呼吸道傳染病，近年來越來越多的研究表明Mccp與其他野生物種之間也存在相互作用，如野山羊、瞪羚、藏羚羊等，均已有感染Mccp的臨床病例發(fā)生[13]。此外，在其他未受感染威脅的物種，如水牛、黑斑羚等體內(nèi)也已檢測到特異性抗體的存在[14]。因此，除了解決現(xiàn)已證實的感染宿主之外，在未來的研究方向上，應(yīng)更加重視其他家養(yǎng)反芻動物，尤其是綿羊在維持感染方面的流行病學(xué)作用。已有多位學(xué)者在綿羊體內(nèi)直接或間接的檢測到Mccp以及綿羊在Mccp傳播中的臨床參與[15]，盡管一些作者已斷定其參與了CCPP的維持和傳播，但其真正的流行病學(xué)作用仍需進一步研究闡明[16]。

Mccp具有高度傳染性，可以在極短的時間內(nèi)通過近距離直接接觸傳播，在沒有進行事先藥物預(yù)防和免疫接種的群體中傳播更為嚴(yán)重。宿主的年齡和性別對感染幾乎沒有影響[9]。Mccp的特征性呼吸道臨床病變自最早發(fā)現(xiàn)以來已在文獻中廣泛描述，主要是伴有單側(cè)紅細(xì)胞增生、粘連的胸膜肺炎、胸膜炎和胸腔積液。

有學(xué)者進行了以自然感染為模型的研究及實驗?zāi)M，最終詳細(xì)描述了由Mccp引起的間質(zhì)小葉內(nèi)肺水腫與由其他支原體如山羊支原體山羊亞種（Mycoplasma capricolumsubsp.capricolum， Mcc）或絲狀支原體山羊亞種（Mycoplasma mycoidessubsp.capricolum，Mmc）引起的小葉間隔增厚之間的差異[17]。近年來在野生動物中爆發(fā)的Mccp感染臨床癥狀與家畜結(jié)果相同，但野生物種可能在沒有任何臨床表現(xiàn)的情況下出現(xiàn)易受感染的狀態(tài)[14]。

Mccp是絲狀支原體簇中的一員，簇內(nèi)支原體間相互影響，給診斷和分離帶來了困難。有研究表明Mccp菌株出現(xiàn)了有限的種內(nèi)變異現(xiàn)象[18－19]，但目前獲得的數(shù)據(jù)已經(jīng)足夠?qū)哂胁煌餍胁W(xué)特征的菌株進行分類[20－21]，并將五種不同的進化株劃分為兩個不同的進化譜系。最近，有學(xué)者利用程序多位點序列分析（MLSA）分型的高判別能力，證實了Mccp與絲狀支原體簇之間的相互關(guān)系[22]。

目前已有的研究缺乏對于Mccp感染宿主后與宿主之間相互作用的數(shù)據(jù)，有研究顯示在首次疫苗接種后1～2周內(nèi)出現(xiàn)針對Mccp的特異性免疫應(yīng)答，最高抗體滴度出在接種后3～5周，隨后抗體迅速減少[23]。且在某些病例中，慢性感染能夠在不引起顯著的血清學(xué)反應(yīng)的條件下發(fā)生，這使得其在感染動物中的診斷變得困難。

3 臨床癥狀和病理變化

山羊傳染性胸膜肺炎的臨床癥狀，根據(jù)病程和臨床癥狀，可分為最急性、急性和慢性3種類型。最急性病初體溫增高，可達(dá)41～42℃，極度萎頓，食欲廢絕，呼吸急促而有痛苦的鳴叫，數(shù)小時后出現(xiàn)肺炎癥狀，呼吸困難，咳嗽，并流漿液性帶血鼻液，肺部叩診呈濁音或?qū)嵰?，聽診肺泡呼吸音減弱、消失或呈捻發(fā)音。1～2 d后病羊臥地不起，呼吸極度困難并伴有全身顫動，粘膜高度充血發(fā)紺，最后衰弱，窒息死亡，病程一般為4～5 d。急性最常見，病初體溫升高，繼之出現(xiàn)短而濕的咳嗽，伴有漿性鼻漏，4～5 d后一側(cè)胸膜出現(xiàn)肺炎癥狀，高熱稽留不退，食欲銳減，呼吸困難和痛苦呻吟，腰背拱起，多數(shù)懷孕母羊發(fā)生流產(chǎn)，最后病羊極度萎頓衰弱而死，幸而不死者轉(zhuǎn)為慢性。慢性多見于夏季，病程可維持2個月以上，病羊全身癥狀輕微，間有咳嗽和腹瀉，被毛粗亂無光[24]。

典型的病理變化在胸腔，呈現(xiàn)肺炎，常見一側(cè)肺肝樣變，胸腔有纖維素性液體滲出，胸膜與肺臟嚴(yán)重粘連。感染的肺臟腫大，實質(zhì)化，呈現(xiàn)灰紅相間的顏色，但肺臟的間質(zhì)沒有增寬。在山羊傳染性胸膜肺炎的流行地區(qū)，該病還要與巴氏桿菌病進行區(qū)分，巴氏桿菌病引起兩側(cè)肺臟的損傷，肺臟的邊緣容易感染，感染肺臟色澤均一[25]。

有關(guān)山羊傳染性胸膜肺炎的致病機理方面的研究資料較少，也不夠深入。曾有研究表明支原體引起的自限性呼吸道疾病與IL－17的表達(dá)水平密切相關(guān)，IL－17參與支原體感染的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)歸[26－27]。最近的相關(guān)研究通過體內(nèi)外實驗證實了IL－17及其相關(guān)細(xì)胞因子、中性粒細(xì)胞去化因子以及中性粒細(xì)胞介導(dǎo)了CCPP免疫病理損傷[28]。

4 診斷和防控策略

CCPP的診斷較為復(fù)雜，其致病因子Mccp曾被認(rèn)為是體外培養(yǎng)最困難的支原體之一，且Mccp與其他多種支原體物種存在較近的遺傳親緣關(guān)系，使得鑒別診斷愈發(fā)困難，此外由于存在其他能引起類似呼吸道癥狀的病原體，如小反芻獸疫病毒、多殺性巴氏菌以及Mmc、Mcc等，都使鑒別診斷變得愈發(fā)困難，大量文獻中對于CCPP病因及致病因子也存在混淆[29]。在一些病例中，Mccp也會與其他病原混合作用于宿主[15]，這些情況都需要通過傳統(tǒng)的胸膜液或肺部樣本微生物分離的方法進行實驗室確診。

4.1 病原分離鑒定 病原分離鑒定是目前OIE確認(rèn)本病在某地區(qū)流行的主要依據(jù)。由于除Mccp之外的其他病原如絲狀支原體山羊亞種、綿羊肺炎支原體等也能引起山羊傳染性胸膜肺炎相近的癥狀，難以從臨床上進行區(qū)分。因此對CCPP病原的確診最好是得到純培養(yǎng)物，再對純培養(yǎng)物進行形態(tài)特征鑒定、生化鑒定、血清學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷，這樣才能最終確診。

Mccp體外生長非常困難，此外樣品長途運輸也會導(dǎo)致支原體的失活。最佳樣品是富含支原體的胸水、肝變區(qū)和非肝變區(qū)交界處的肺組織。在分離過程中，Mccp常會被其他易于生長的支原體所遮蔽，這也是導(dǎo)致Mccp分離困難的問題之一。尤其綿羊肺炎支原體經(jīng)常比Mccp易于培養(yǎng)且廣泛存在于山羊支原體呼吸道中，是Mccp分離過程中最為常見的干擾支原體，但幸運的是能通過綿羊肺炎支原體所特有的“無中心臍”菌落特征在克隆純化早期將其分離。其他影響Mccp分離的因素還包括抗生素，抗生素已廣泛應(yīng)用于CCPP的治療，這也使得在應(yīng)用抗生素的發(fā)病地區(qū)分離Mccp變得愈加困難。

4.2 分子生物學(xué)診斷 利用分子生物學(xué)方法進行Mccp診斷，最早是使用Cap－21基因探針將Mccp、Mcc與其他支原體簇的成員進行區(qū)分，隨后再用F38－12基因探針將 Mccp和 Mcc區(qū)分開來[30]。但該方法操作過于復(fù)雜，逐漸被更為方便快捷的PCR方法取代。Bashiruddin[31]和Hotzel[32]等分別根據(jù)Cap－21探針設(shè)計了套式PCR擴增方法，可用于鑒定絲狀支原體簇成員。1996年，Bascunana等根據(jù)絲狀支原體簇成員的16SrRNA兩個操縱子序列中酶切位點的差異建立了鑒定Mccp的PCR－限制性酶切分析方法（PCR－Restriction enzyme analysis，PCR － REA）[33]。 根據(jù) 16S rRNA 基因建立的PCR－REA方法甚至可以從吸附有胸水的干燥濾紙片上成功檢測Mccp，這種方法給檢測樣品的運輸帶來很大方便[34]。Malin Heldtander等于2001年提出，鑒定Mccp菌株的多態(tài)性可以作為檢測CCPP在小范圍地區(qū)流行的流行病學(xué)標(biāo)志，并以此來研究該種的分子進化[35]。2004年，Woubit等依據(jù)成員的Adi基因差異設(shè)計了一套鑒定Mccp的PCR方法，除絲狀支原體絲狀亞種大菌落型（Mycoplasma mycoides subsp.mycoides biotype LC，MmmLC）代表株Y－goat可出現(xiàn)一條非特異性的微弱條帶，只有Mccp能擴增出特異性目的條帶，并在此基礎(chǔ)上又建立了一種特異性好、靈敏度高的實時定量PCR方法用于檢測Mccp[36]。在該PCR方法基礎(chǔ)上，2008年建立了一種實時定量PCR方法用于檢測Mccp，提高了檢測的特異性，敏感性更是提高了2～3個數(shù)量級[37]。

Sophie Lorenzon等設(shè)計了用于檢測和定量Mccp DNA的快速、靈敏和特異的實時PCR方法，利用常規(guī)PCR引物即可進行擴增，敏感性遠(yuǎn)超過傳統(tǒng)常規(guī)PCR試驗[38]。Anne Liljander等設(shè)計了一種快速敏感而特異的方法，采用重組酶聚合酶擴增方法進行等溫DNA擴增來檢測CCPP，在15～20 min內(nèi)即可產(chǎn)生熒光信號，且無需提取DNA，利用陽性動物胸水即可進行有效工作[39]。Salling H K等設(shè)計定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（QPCR）方法檢測Mccp，具有高靈敏度和特異性[40]。也有學(xué)者引入了基于磁珠的液體懸浮液陣列偶聯(lián)的多重PCR測定法，用于特異性檢測包括Mccp在內(nèi)的幾種反芻動物的支原體，但到目前為止，僅在牛中獲得了樣品的田間結(jié)果[41]。

4.3 血清學(xué)檢測方法 免疫結(jié)合試驗以及其他的血清學(xué)技術(shù)，如補體結(jié)合、血凝血抑、ELISA以及乳膠凝集試驗等也已用于CCPP的診斷[42]，然而在某些情況下，如慢性感染，或與相近支原體存在交叉反應(yīng)時，難以獲得能夠進行免疫反應(yīng)的體液用于檢測。隨后，進行了相關(guān)研究解決了這些特異性的問題[43]，但仍缺乏更具體可行的檢測方法，這也仍是評估全球范圍CCPP流行和造成經(jīng)濟影響的真正障礙?；谧钄郋LISA的新型競爭ELISA試劑盒已被證明具有高度特異性，僅針對Mccp不與其他病原產(chǎn)生交叉反應(yīng)，可用于評估未經(jīng)疫苗接種的國家或地區(qū)的CCPP患病率，還可用于檢測疫苗接種的保護效力[44]。

4.4 防控 控制受威脅地區(qū)CCPP的策略主要包括疫苗和常規(guī)抗生素，在及時給藥的情況下，抗生素對治療CCPP有效，但在許多情況下，這些藥物并不能預(yù)防臨床癥狀或抑制肺部病變的發(fā)展[45]。而在非疫區(qū)，撲殺患病動物則是最佳選擇。

實際應(yīng)用中使用最多的疫苗是滅活疫苗，主要在非洲國家大量使用，如肯尼亞等。最初的CCPP接種可以追溯到十九世紀(jì)末期，在澄清了CCPP的病因?qū)W后，針對Mccp的疫苗接種試驗是使用多次傳代后毒力減弱的F38株制成的活疫苗進行免疫的，在通過氣管給藥后顯示出了針對CCPP的良好保護性[46]。隨后，有研究人員針對菌株BQT75研制了類似的活疫苗。但在田間，仍主要使用由弗氏不完全佐劑乳化的滅活疫苗，與使用氫氧化鋁佐劑相比，弗氏不完全佐劑乳化疫苗能產(chǎn)生更強、更持久的保護力。

5 展 望

目前，有關(guān)山羊傳染性胸膜肺炎的具體致病機理仍不明確，仍需要進行進一步的研究。在CCPP的診斷方面，金標(biāo)準(zhǔn)仍是通過OIE確立的病原分離鑒定的方法來進行鑒別，但也不乏大量新型診斷方法的研究，最為熱門的即是各種分子生物學(xué)檢測方法，不斷改進的PCR方法檢測敏感度和特異性不斷提高，但目前為止還未進行田間驗證，僅取得了實驗室鑒定成果，且PCR本身存在的一些特性使之較難成為最準(zhǔn)確的診斷方法。而在血清學(xué)診斷方法方面的研究較分子生物學(xué)診斷方法少，主要是由于血清學(xué)診斷方法獲得特異性免疫反應(yīng)的抗原用于檢測，因此在進行血清學(xué)診斷方法的研究時也應(yīng)著重注意特異性方面的問題，篩選能與支原體簇其他支原體區(qū)分開來的特異性抗原尤為重要。

在CCPP的防控方面，現(xiàn)已證實了本病并非之前廣泛認(rèn)為的僅感染山羊，而是在其他野生動物體內(nèi)也得到了證實，因此在下一步的防控策略中，不僅應(yīng)當(dāng)考慮現(xiàn)已證實的易感動物對本病的傳播和維持作用，同時也應(yīng)該注意保護其他同樣有可能具有感染風(fēng)險的動物，避免該病傳播風(fēng)險進一步擴大。同時也應(yīng)進一步的研究區(qū)分感染山羊的Mccp病原與感染其他野生動物的Mccp病原之間是否存在差異，以及目前應(yīng)用于山羊的治療和免疫方法在同樣感染的野生動物中是否適用等問題。