王佰濤，王一雯，許 杰，馬 煥，2，陳國(guó)參，劉德海，2

（1.河南省科學(xué)院生物研究所，河南鄭州450008；2.河南省工業(yè)酶工程技術(shù)研究中心，河南鄭州450008）

葡萄糖氧化酶（GOD）（EC1.1.3.4）是一種具有良好特性的需氧脫氫酶，能夠催化β-D-葡萄糖脫氫氧化生成葡萄糖內(nèi)酯和過(guò)氧化氫，葡萄糖內(nèi)酯會(huì)轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸。目前葡萄糖氧化酶已經(jīng)廣泛應(yīng)用于飼料業(yè)和食品業(yè)的各個(gè)領(lǐng)域，其在化學(xué)、醫(yī)藥、紡織和其他生物技術(shù)領(lǐng)域中也有一些新穎的應(yīng)用（Bankar等，2009）。

1 葡萄糖氧化酶的性質(zhì)

葡萄糖氧化酶廣泛存在于自然界當(dāng)中，其中微生物來(lái)源占絕大部分，主要是青霉和黑曲霉（Eremin等，2004）。高純度葡萄糖氧化酶為近白色或淡黃色粉末，易溶于水，幾乎不溶于有機(jī)溶劑。不同來(lái)源的葡萄糖氧化酶分子量也有所不同，一般為130～180 kDa。葡萄糖氧化酶對(duì)底物有較高的特異性，對(duì)β-D-葡萄糖的催化活性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于α-D-葡萄糖，且底物中任一細(xì)微的結(jié)構(gòu)改變都可能影響到催化活性。如果就酶促反應(yīng)速率而言，以β-D-葡萄糖為底物的氧化速率作參考（100%），使用黑曲霉葡萄糖氧化酶時(shí)，只有2-脫氧-D-葡萄糖、4-O-甲基-D-葡萄糖、6-脫氧-D-葡萄糖的氧化速率能夠保持在較好的速率范圍內(nèi)（10%～30%），當(dāng)使用其他底物參與反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)速率還不到β-D-葡萄糖氧化速率的2%（Leskovac等，2005）。

大多數(shù)酶的活性與活性位點(diǎn)中氨基酸的電離狀態(tài)息息相關(guān)，因此其所處的pH環(huán)境對(duì)活性影響很大。葡萄糖氧化酶的最佳pH為3～7，在pH高于7或者低于3時(shí)活性較低 （Sumaiyas等，2015）。大多數(shù)真菌或酵母菌來(lái)源的葡萄糖氧化酶在酸性至中性范圍內(nèi)有最佳活性，例如黑曲霉和產(chǎn)黃青霉的最適pH為5～6（Kalisz等，1991）。但也存在少數(shù)真菌來(lái)源的葡萄糖氧化酶在偏堿性范圍內(nèi)活性較好，例如繩狀青霉和變灰青霉葡萄糖氧化酶最適pH為6～8（Sukhacheva等，2004）。葡萄糖氧化酶在30～60℃活性較好，50℃左右活性最優(yōu)，在溫度高于60℃或者低于30℃時(shí)活性較低。例如尼崎青霉葡萄糖氧化酶在40～60℃活性較好（Kalisz等，1991）。葡萄糖氧化酶還存在一些活性抑制劑如Ag+、Hg2+、Cu2+、羥胺、肼、苯肼、二甲酮和硫酸氫鈉等，這些金屬離子和化學(xué)物質(zhì)的存在會(huì)抑制其活性（Nakamura等，1968）。孫丹等（2016）研究了銀離子誘導(dǎo)葡萄糖氧化酶結(jié)構(gòu)的變化發(fā)現(xiàn)，銀離子會(huì)與葡萄糖氧化酶的輔基FAD結(jié)合進(jìn)而影響其活性。

2 葡萄糖氧化酶的結(jié)構(gòu)及催化機(jī)制

從結(jié)構(gòu)上來(lái)說(shuō)，葡萄糖氧化酶是一種含有黃素的糖蛋白，由兩個(gè)相同的80 kDa亞基組成，每個(gè)亞基含有一個(gè)黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD），其以黃素腺嘌呤二核苷酸為輔基，因而亦可稱(chēng)為黃素蛋白或黃酶。每個(gè)葡萄糖氧化酶亞基都含有一個(gè)由四個(gè)α-螺旋支撐一個(gè)反平行的β折疊用來(lái)與底物結(jié)合。FAD輔基在葡萄糖氧化酶催化過(guò)程中充當(dāng)氧化還原的電子載體，在反應(yīng)中被還原為FADH2。研究發(fā)現(xiàn)大部分從微生物中得到的葡萄糖氧化酶含有約11%～13%甘露糖型的碳水化合物，其中絕大部分都是以氮苷和氧苷形式與酶的蛋白主鏈相連接（Nakamara等，1968）。

對(duì)葡萄糖氧化酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)研究表明，其活性部位由位于疏水口袋底部的FAD構(gòu)成，此結(jié)構(gòu)可與葡萄糖相結(jié)合，催化反應(yīng)的中心是FAD異四氮嗪環(huán)的N-5位。酶的活性位點(diǎn)除了FAD外，還有三種與催化密切相關(guān)的氨基酸側(cè)鏈：His 516（pKa=6.9）、Glu 412（pKa=3.4）、His 559（pKa＞8）。Glu 412部分埋藏在蛋白質(zhì)分子中，與His 559通過(guò)氫鍵連接，而His 516的側(cè)鏈更加靈活，更容易暴露在外，并且這些氨基酸殘基與葡萄糖氧化酶的反應(yīng)速率密切相關(guān)（Leskovac等，2005）。

從催化機(jī)制上來(lái)說(shuō)，葡萄糖氧化酶的催化反應(yīng)不僅需要糖分子作為還原劑和電子供體，還需要氧化劑和電子受體共同完成催化反應(yīng)。該反應(yīng)可分為一個(gè)還原半反應(yīng)和一個(gè)氧化半反應(yīng)。在還原半反應(yīng)中，首先葡萄糖與酶的結(jié)合會(huì)引起水分子從活性部位排出，葡萄糖C-1位置羥基的質(zhì)子轉(zhuǎn)移至酶的堿性側(cè)鏈上（His 516），即后者發(fā)生質(zhì)子化，葡萄糖被氧化為葡萄糖內(nèi)酯，然后將C-1位置氫轉(zhuǎn)移至FAD異四氮嗪環(huán)的N-5位置，生成質(zhì)子化的His 516和FADH2（Witt等，2000）。在氧化半反應(yīng)中，第一步是氧氣擴(kuò)散進(jìn)入活性中心與FADH2發(fā)生接觸，接著還原型輔基FADH2被氧分子氧化為FAD，氧分子被還原為過(guò)氧化氫。這個(gè)反應(yīng)是通過(guò)兩個(gè)單電子轉(zhuǎn)移完成，反應(yīng)的中間產(chǎn)物是超氧陰離子自由基和黃素半醌自由基（Leskovac等，2005）。還原半反應(yīng)和氧化半反應(yīng)共同組成葡萄糖氧化酶的氧化還原體系。

3 葡萄糖氧化酶的應(yīng)用

3.1 飼料 微生物飼料酶制劑作為一種飼料添加劑，能夠提高動(dòng)物對(duì)飼料的消化利用，改善動(dòng)物的代謝機(jī)能，近年來(lái)在飼料中應(yīng)用廣泛。其中葡萄糖氧化酶于1999年7月26日被中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部第105號(hào)文正式批準(zhǔn)列入《允許使用的飼料添加劑品種目錄》，目前主要應(yīng)用在家禽和家畜配合飼料中。

3.1.1 在家禽配合飼料中的應(yīng)用 在家禽配合飼料中添加葡萄糖氧化酶可以提高家禽的產(chǎn)蛋性能，減少抗生素的使用量，降解飼料中的霉菌毒素，促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)。趙國(guó)先等（2007）研究表明，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組飼料中添加0.1%～0.4%葡萄糖氧化酶后產(chǎn)蛋率得到提高，破軟蛋率有所下降，并且飼料中添加0.4%葡萄糖氧化酶能夠顯著增加白蛋白和血清總蛋白含量。湯海鷗等（2016）研究在飼料中添加不同劑量的葡萄糖氧化酶對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響及替代抗生素的效果。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組肉雞全期日增重顯著提高，料肉比顯著下降；與添加正常量抗生素的對(duì)照組相比，添加酶制劑的試驗(yàn)組肉雞的各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)無(wú)顯著差異，說(shuō)明用葡萄糖氧化酶替代抗生素來(lái)提高動(dòng)物機(jī)體的免疫力效果顯著。并且研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖氧化酶可以改善家禽肉質(zhì)，降解飼料中的霉菌毒素和霉變飼料對(duì)動(dòng)物的傷害。孫春陽(yáng)等（2014）研究葡萄糖氧化酶和酵母硒復(fù)合添加劑對(duì)白羽雞抗氧化性能及肉質(zhì)的影響，結(jié)果表明添加二者復(fù)合劑可以提高白羽雞抗氧化能力，改善雞肉肉質(zhì)。湯海鷗等（2015）在肉鴨飼料中添加葡萄糖氧化酶探究其解除黃曲霉毒素B1的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葡萄糖氧化酶制劑能夠改善攻毒肉鴨的生長(zhǎng)性能，降低攻毒肉鴨死亡率，說(shuō)明葡萄糖氧化酶具有解除霉菌毒素的能力。

3.1.2 在家畜配合飼料中的應(yīng)用 在家畜配合飼料中添加葡萄糖氧化酶可以提高對(duì)飼料的吸收利用率，促進(jìn)家畜的生長(zhǎng)。楊久仙等（2011）研究表明，在飼料中添加葡萄糖氧化酶能夠加強(qiáng)仔豬腸道酸性環(huán)境，改善腸道表面結(jié)構(gòu)，提高對(duì)飼料的消化吸收率和利用率，促進(jìn)仔豬的生長(zhǎng)與發(fā)育。林謙等（2015）研究不同水平葡萄糖氧化酶替代氧化鋅對(duì)仔豬抗瀉的作用效果發(fā)現(xiàn)，與氧化鋅組相比，仔豬不僅腹瀉率降低，平均日增重也有所提高，總體效果強(qiáng)于氧化鋅。一頭母豬每年能夠生產(chǎn)的斷奶仔豬重量和斷奶仔豬數(shù)量是評(píng)價(jià)其生產(chǎn)性能的重要指標(biāo)，研究證明葡萄糖氧化酶在提高母豬生產(chǎn)性能方面效果顯著。尤瑞祺等（2017）研究表明，在母豬妊娠后期的飼料中添加適當(dāng)劑量的葡萄糖氧化酶可以提高母豬的生產(chǎn)性能及母豬和仔豬的抗氧化能力。葡萄糖氧化酶在促進(jìn)家畜產(chǎn)后恢復(fù)和促進(jìn)泌乳方面也卓有成效，劉亞娟等（2016）研究表明，飼料中添加0.4%的葡萄糖氧化酶可以顯著提高母兔泌乳性能，促進(jìn)母兔產(chǎn)后體況的恢復(fù)。

3.2 食品 葡萄糖氧化酶可以在食品中作為液體或者粉末添加劑使用，并且常常被歸類(lèi)為抗氧化劑或者防腐劑。在生鮮食品業(yè)，生鮮食品的新鮮程度主要取決于空氣中氧氣的影響。因此，除氧是保存生鮮食品的重要途徑，而目前市場(chǎng)上存在的一些化學(xué)性抗氧化劑會(huì)對(duì)人體的健康產(chǎn)生不利影響。葡萄糖氧化酶作為一種綠色健康的食品添加劑，能夠?qū)Ｒ坏叵难鯕?，阻止生鮮食品發(fā)生變質(zhì)或者氧化，延長(zhǎng)食品的保鮮期。例如蘋(píng)果汁當(dāng)中含有許多酚類(lèi)物質(zhì)，在空氣中極易氧化加深為褐色，將葡萄糖氧化酶按0.4%添加量加入到蘋(píng)果汁中，可起到保鮮作用（王磊等，2018）。另外通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖氧化酶對(duì)海鮮食品及茶葉等的保鮮效果也十分顯著（徐德峰等，2017），能夠很好地保持食品的口感風(fēng)味。當(dāng)葡萄糖氧化酶用作食品包裝中的防腐劑時(shí)，如果發(fā)生包裝破裂或空氣泄漏，葡萄糖氧化酶和氧氣反應(yīng)將葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸，導(dǎo)致pH下降，這樣可以根據(jù)包裝中pH條帶的變化來(lái)判斷包裝是否完整。某些特殊的包裝也允許少量空氣泄露，其原理是通過(guò)葡萄糖氧化酶產(chǎn)生少量的過(guò)氧化氫來(lái)抑制微生物的生長(zhǎng)。

在面制品加工業(yè)中，加工面條過(guò)程中添加葡萄糖氧化酶制劑，可以顯著改善面團(tuán)的強(qiáng)度和彈性，有效地提高面條的嚼勁，增加耐煮性（封雯瑞等，2000）。此外葡萄糖氧化酶對(duì)饅頭芯的硬度具有顯著地改善效果（林金劍等，2011）。作用原理是其反應(yīng)過(guò)程產(chǎn)生的過(guò)氧化氫可以將面筋蛋白分子的巰基轉(zhuǎn)化為二硫鍵，增加了強(qiáng)度，提高面制品彈性（夏萍等，1999）。但如果葡萄糖氧化酶產(chǎn)生過(guò)多的過(guò)氧化氫就會(huì)對(duì)其催化活性產(chǎn)生抑制，因此食品級(jí)葡萄糖氧化酶制劑中通常會(huì)加入過(guò)氧化氫酶，以防止過(guò)氧化氫積累過(guò)多對(duì)葡萄糖氧化酶的活性產(chǎn)生影響（Bao等，2003）。

3.3 葡萄糖酸生產(chǎn) 葡萄糖氧化酶在氧化葡萄糖之后會(huì)產(chǎn)生葡萄糖酸，而葡萄糖酸及其衍生鹽在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用十分廣泛，例如食品、紡織印染、金屬表面清潔、凝結(jié)劑、化妝品、藥品等，如作為食品添加劑，其可以用作食品中的酸度調(diào)節(jié)劑、膨松劑、抗氧化劑、螯合劑等（Brookes等，2005）。在工業(yè)上葡萄糖酸由發(fā)酵獲得，每年產(chǎn)量在五萬(wàn)噸至十萬(wàn)噸（Singh等，2005），但通過(guò)發(fā)酵過(guò)程來(lái)生產(chǎn)葡萄糖酸，時(shí)間長(zhǎng)，投入大，并且發(fā)酵完成后分離程序復(fù)雜，生產(chǎn)成本太高。Lantero等（2001）用生物酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)葡萄糖酸，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化率已經(jīng)能夠達(dá)到較高水平，不僅節(jié)約了發(fā)酵時(shí)間，也省去了復(fù)雜的分離除雜過(guò)程。盡管具有這些潛在的優(yōu)勢(shì)，目前工業(yè)應(yīng)用酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)葡萄糖酸還比較少，說(shuō)明在大規(guī)模應(yīng)用之前還有許多困難要克服。

3.4 葡萄糖氧化酶?jìng)鞲衅?目前市場(chǎng)上存在的生物傳感器中，大多數(shù)是葡萄糖氧化酶生物傳感器，并且其主要基于固定化葡萄糖氧化酶。目前葡萄糖氧化酶?jìng)鞲衅骺梢詰?yīng)用在金屬離子、葡萄糖的濃度監(jiān)測(cè)及醫(yī)學(xué)方面。例如汞離子在酸性環(huán)境通過(guò)與葡萄糖氧化酶的某些活性位點(diǎn)結(jié)合能夠抑制其活性，據(jù)此湯琳等（2005）通過(guò)聚苯胺膜制作葡萄糖氧化酶電極，然后用戊二醛交聯(lián)固定葡萄糖氧化酶，能夠完成酸性環(huán)境中對(duì)汞離子的含量測(cè)定，且不受其他重金屬離子的影響。張彥等（2009）通過(guò)應(yīng)用殼聚糖包埋法將葡萄糖氧化酶固定到雞蛋膜上，制成葡萄糖氧化酶生物傳感器。此傳感器根據(jù)葡萄糖氧化酶消耗的葡萄糖和氧氣的正比關(guān)系，運(yùn)用氧電極能夠?qū)⒀鯕夂孔兓D(zhuǎn)化為電信號(hào)，據(jù)此測(cè)定葡萄糖含量。在醫(yī)藥領(lǐng)域，通過(guò)刺破手指采血可以應(yīng)用葡萄糖氧化酶?jìng)鞲衅鳈z測(cè)血糖濃度，但這種方法存在有創(chuàng)口、不能連續(xù)監(jiān)測(cè)等缺點(diǎn)。目前開(kāi)發(fā)的熒光式葡萄糖氧化酶?jìng)鞲衅髂軌虮粦?yīng)用于體內(nèi)血糖濃度的連續(xù)監(jiān)測(cè)，其原理是葡萄糖氧化酶輔基FAD氧化狀態(tài)的變化會(huì)影響葡萄糖氧化酶的熒光強(qiáng)度，然后通過(guò)監(jiān)測(cè)葡萄糖氧化酶熒光強(qiáng)度的變化來(lái)監(jiān)測(cè)血糖濃度（Brown等，2006）。與傳統(tǒng)的刺破手指采血相比，其具有能夠?qū)崿F(xiàn)連續(xù)監(jiān)測(cè)血糖濃度、無(wú)創(chuàng)口、反應(yīng)靈敏等優(yōu)勢(shì)。另外，在癌癥診斷方面，葡萄糖氧化酶?jìng)鞲衅髂軌蛴糜趯?duì)某些腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)，并且一些對(duì)應(yīng)的癌癥治療策略也被開(kāi)發(fā)出來(lái)（Fu等，2018）。

3.5 其他行業(yè) 目前葡萄糖氧化酶并不局限于上述應(yīng)用。例如在紡織業(yè)中采用葡萄糖氧化酶環(huán)保型生物漂白工藝代替化學(xué)漂白具有良好的前景（王石磊等，2010）?；瘜W(xué)漂白要求在堿性條件，且所需溫度也較高，而葡萄糖氧化酶生物漂白則可以在低溫中性條件下進(jìn)行。這意味著這種處理方法能夠在能源和污水處理方面節(jié)省大量費(fèi)用。在生物燃料電池方面，葡萄糖氧化酶用作催化劑的燃料電池是一種環(huán)保電池，能量轉(zhuǎn)化率較高，但目前技術(shù)并不成熟，需要對(duì)其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)（呂豐等，2006）。

4 葡萄糖氧化酶在飼料中的作用機(jī)理

4.1 調(diào)節(jié)腸道微生物平衡，提高腸道消化能力葡萄糖氧化酶消耗葡萄糖生成的葡萄糖酸呈酸性，可以降低腸道的pH，抑制有害菌群生長(zhǎng)，促進(jìn)有益菌群生長(zhǎng)，并且葡萄糖酸能夠促進(jìn)腸道中的食糜產(chǎn)生小分子有機(jī)物，為腸道有益菌的生長(zhǎng)提供能量（Tsukahara等，2002），進(jìn)而調(diào)節(jié)腸道微生物平衡。生成的過(guò)氧化氫具有廣譜的殺菌作用，研究表明其可以抑制大腸桿菌和沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)（Bankar等，2009），但這種抑菌能力和抗生素的作用機(jī)理不同，不會(huì)產(chǎn)生耐藥性，因此將其應(yīng)用在畜牧業(yè)中屬于綠色養(yǎng)殖的發(fā)展方向。消化道pH的降低有利于消化酶原的激活，能夠促進(jìn)動(dòng)物產(chǎn)生促胰液素，提高胰酶水平，提高消化道的消化活性（冷向軍等，2002）。宋海彬等（2010A）研究表明，在飼料中添加葡萄糖氧化酶能夠提高肉雞腸道絨毛高度，降低腸道隱窩深度，改善腸道胰蛋白酶和淀粉酶的活性，提高腸道消化能力。

4.2 提高抗氧化能力 自由基存在于動(dòng)物機(jī)體之內(nèi)，如果積累過(guò)多會(huì)造成機(jī)體在分子及細(xì)胞水平的損傷，進(jìn)而誘發(fā)各種疾病，葡萄糖氧化酶可以消耗氧氣產(chǎn)生過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫能夠刺激有益菌群產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶，后者可以消除機(jī)體內(nèi)的自由基，保護(hù)腸道上皮細(xì)胞，減少腸道損傷（胡常英等，2014）。血清中脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛的含量能夠反映機(jī)體清除自由基的能力，研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖氧化酶能夠升高血清中超氧化物歧化酶水平，降低丙二醛水平，提高動(dòng)物機(jī)體的抗氧化能力。此外自由基的產(chǎn)生會(huì)影響精卵結(jié)合，影響動(dòng)物的生產(chǎn)性能，清除自由基還可以提高動(dòng)物的生產(chǎn)能力（尤瑞祺等，2017）。

4.3 改善生化指標(biāo) 甲狀腺激素和生長(zhǎng)激素能夠促進(jìn)動(dòng)物的代謝，增強(qiáng)蛋白質(zhì)的合成，與動(dòng)物的生長(zhǎng)速度息息相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖氧化酶可以提高血清中有關(guān)激素如生長(zhǎng)激素、碘甲狀腺原氨酸及甲狀腺素的含量，因此在飼料中添加葡萄糖氧化酶可以促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)（湯海鷗等，2015）。此外，肌酸激酶是存在于肌細(xì)胞中的一種特異性酶，血液肌酸激酶水平升高會(huì)增加家禽心肌、骨骼肌、腦組織病變的風(fēng)險(xiǎn)，而研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖氧化酶能夠降低細(xì)胞膜通透性，抑制肌酸激酶從肌細(xì)胞進(jìn)入血液，從而降低動(dòng)物發(fā)生疾病的風(fēng)險(xiǎn)（趙國(guó)先等，2007）。

4.4 提高免疫力 研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖氧化酶可以提高動(dòng)物的免疫力（Wang等，2018），提高免疫球蛋白IgA水平（宋海彬等，2010B），減少抗生素的使用。例如在母豬妊娠后期，由于胎兒快速生長(zhǎng)容易在體內(nèi)累積大量自由基，產(chǎn)生炎性因子，會(huì)降低免疫球蛋白水平，從而降低動(dòng)物機(jī)體的免疫力，通過(guò)在飼料中添加葡萄糖氧化酶能夠減少免疫力低下胎兒的出現(xiàn)。此外，在飼料中添加葡萄糖氧化酶之后，腸道中的有益菌群增多可以提高動(dòng)物機(jī)體的特異性和非特異性免疫，進(jìn)而提升機(jī)體的免疫防御能力（劉輝等，2010）。

5 結(jié)語(yǔ)與展望

葡萄糖氧化酶作為一種綠色環(huán)保的酶制劑，對(duì)機(jī)體無(wú)毒害作用，在飼料中應(yīng)用能夠改善動(dòng)物生長(zhǎng)性能，提高畜牧業(yè)產(chǎn)值，在食品中應(yīng)用可以改善口感，延長(zhǎng)保鮮時(shí)間，并且在生物燃料電池等新興產(chǎn)業(yè)中也具有廣泛的應(yīng)用前景。但目前葡萄糖氧化酶的產(chǎn)量和質(zhì)量仍然有待提升，下一步希望通過(guò)基因工程技術(shù)能夠不斷提高酶的活力和表達(dá)量，其潛在利用價(jià)值仍有待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。