蘇杰 馬春梅 邵宏超 楊馥宇 劉巖 葛嫣然

自噬是一個吞噬自身細胞質(zhì)蛋白或細胞器，并將其包裹進囊泡，與溶酶體形成自噬溶酶體，對包被物進行降解的過程[1-2]。自噬調(diào)控機制的異常可導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生發(fā)展，甚至誘發(fā)癌變[3-4]。研究指出，高遷移率族蛋白1(high mobility group protein 1，HMGB1)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并有證據(jù)表明其與視網(wǎng)膜母細胞瘤的浸潤及自噬相關(guān)[5]。miR-34a已被證實與肝癌相關(guān)，能降低肝癌細胞的惡性行為，可作為潛在的抗腫瘤治療靶點[6]。但對于miR-34a如何調(diào)節(jié)人視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞自噬鮮有報道。因此本研究通過測定HMGB1及miR-34a的表達，探討HMGB1與miR-34a調(diào)節(jié)人視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞自噬的作用機制。

1材料與方法

1.1主要試劑及儀器人視網(wǎng)膜母細胞瘤Y79細胞系(深圳豪地華拓生物)，胎牛血清、Opti-MEMⅠ培養(yǎng)液、RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，慢病毒載體系統(tǒng)(中國吉凱基因公司)，miR-34a、HMGB1慢病毒包裝系統(tǒng)(廣州復(fù)能基因公司)，Trizol裂解液(美國Thermo公司)，磷酸化綠色熒光蛋白-LC3質(zhì)粒由廣州華韻生物科技有限公司設(shè)計合成；高純度質(zhì)粒提取試劑盒(美國Sigma公司)，miR-34a的RT-PCR試劑盒(上海哈靈生物科技有限公司)；Attune NxT流式細胞儀(美國Thermo公司)，熒光倒置顯微鏡(德國Lavisin Biotec公司)，Multiskan Go酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)，CM-120透射電子顯微鏡(荷蘭飛利浦公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與分組Y79細胞株細胞懸浮生長，呈團片狀，孵育細胞覆蓋達到培養(yǎng)瓶的80%以上時傳代。吸棄舊培養(yǎng)液，取生長狀態(tài)良好的Y79細胞，使用PBS緩沖液漂洗1次，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)至細胞間隙變寬。使用3 mL無菌巴氏管輕柔吹打細胞，離心，去上清，加入新的培養(yǎng)液置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d傳代1次。分組：取處于對數(shù)期的Y79細胞，制備單細胞懸液，將轉(zhuǎn)染miR-34a的慢病毒載體、轉(zhuǎn)染HMGB1載體及共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMGB1的慢病毒載體及培養(yǎng)液接種至Y79細胞。按照接種載體分組，將Y79細胞株分為4組，分別為轉(zhuǎn)染miR-34a組、轉(zhuǎn)染HMGB1組、共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMGB1組及陰性對照組。

1.2.2miR-34a慢病毒載體的構(gòu)建及cDNA轉(zhuǎn)染獲取的人miR-34a序列，從Genbank中查閱HMGB1的cDNA序列，設(shè)計合成miR-34a及HMGB1前體引物，采用PCR方法擴增含miR-34a及HMGB1前體片段，并克隆至慢病毒載體系統(tǒng)。將帶有miR-34a及HMGB1前體的片段轉(zhuǎn)染Y79細胞，24 h后收集細胞。將4×105mL-1細胞加注于96孔板中，用不含抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞融合度為90%～95%，在Opti-MEMⅠ中加入0.9 μg DNA，在另外培養(yǎng)孔中加入2.0 μL 胎牛血清，室溫下孵育5 min，將兩種試劑混合均勻后共孵育20 min后移至細胞培養(yǎng)板，并置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的環(huán)境中孵育24 h?？偡磻?yīng)體系：逆轉(zhuǎn)錄條件設(shè)為42 ℃，20 min；98 ℃，5 min；4 ℃，5 min，最后將cDNA儲存于-20 ℃冰箱。

1.2.3細胞總RNA的提取及RT-PCR檢測miR-34a的表達人視網(wǎng)膜母細胞瘤總RNA提取，加入Trizol溶液裂解人視網(wǎng)膜母細胞瘤RNA，應(yīng)用核酸蛋白儀和瓊脂糖電泳對提取的RNA進行分析。取總RNA 4 μL，80 ℃水浴5 min，加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，44 ℃孵育72 min終止，留取產(chǎn)物待用。本研究所使用siRNA序列為miR-34a：上游引物5’-CAACAGAAGGCTCGAGCCTCCTGCATCCTTCTTC-3’，下游引物5’-ATTCTGATCAGGATCCTGGAGCTCACTTTCCCAG-3’；以GAPDH為對照：上游引物5’-TAAAGGAACCAGAATCCTGGTCCGGTGT-3’，下游引物5’-CTC-GTTGTCATCTGGCAGGACCGTGTTA-3’。擴增參數(shù)，95 ℃ 9.8 min，60 ℃ 48 s，73 ℃延伸50 s，72 ℃最終延伸10 min，10 ℃保存?；虮磉_分析采用2-△△Ct法測定相對含量，將GAPDH設(shè)為內(nèi)參，取Ct值?！鰿t=Ct目的基因-CtGAPDH；△△Ct=△Ct實驗組-△Ct對照組。

1.2.4Caspase3活性檢測取處于對數(shù)期的Y79細胞接種于96孔板培養(yǎng)基中，每孔加5×103個細胞，孵育72 h后，利用Capase3檢測試劑盒檢測Caspase3活性，以酶標(biāo)儀于波長405 nm處的吸光度(absorbance，A)值表示活性變化，每份樣品檢測6次，取平均值。

1.2.5流式細胞儀定量分析自噬的單丹磺酰尸胺陽性細胞率取4組對數(shù)期Y79細胞，密度為4×105mL-1接種于6孔板，用含miR-34a的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后，用含50 μmol·L-1單丹磺酰尸胺(monodansyl cadaverin，MDC)的新鮮RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2環(huán)境中孵育15 min，PBS洗滌兩次后加500 μL PBS上機，上機前使細胞混勻懸浮呈單個細胞，插入流式細胞儀，488 nm激發(fā)波長，測定MDC陽性細胞染色的熒光強度。

1.2.6透射電孔子顯微鏡下觀察自噬超微結(jié)構(gòu)取對數(shù)生長期Y79細胞，調(diào)整細胞濃度，陰性對照組使用RPMI-1640培養(yǎng)液，其余3組使用miR-34a RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h后收集細胞，PBS洗滌2次，1000 r·min-1離心5 min，后將細胞收集于離心管中，加入戊二醛液，1000 r·min-1離心10 min，靜止30 min，送電鏡室，經(jīng)脫水、浸透、固化、切片，30 g·L-1醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色后采用CM-120透射電子顯微鏡觀察并拍片。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。服從正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1miR-34a轉(zhuǎn)染及效果miR-34a轉(zhuǎn)染Y79細胞72 h后，熒光顯微鏡下觀察到細胞出現(xiàn)綠色熒光，轉(zhuǎn)染率達到87%，且細胞狀態(tài)良好。轉(zhuǎn)染72 h后，RT-PCR測定各組miR-34a及HMGB1的mRNA水平。轉(zhuǎn)染miR-34a組的miR-34a表達水平(2.04±0.46)明顯高于陰性對照組(1.03±0.21)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMGB1組HMGB1(0.42±0.08)的表達明顯低于轉(zhuǎn)染HMGB1組(1.08±0.16)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1轉(zhuǎn)染72 h后熒光顯微鏡下觀察(×200)。A：陰性對照組明視野；B：陰性對照組熒光顯色；C：轉(zhuǎn)染miR-34a組明視野；D：轉(zhuǎn)染miR-34a組熒光顯色；E：轉(zhuǎn)染HMBG1組明視野；F：轉(zhuǎn)染HMBG1組熒光顯色；G：共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMBG1組明視野；H：共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMBG1組熒光顯色

2.2Caspase3活性檢測結(jié)果細胞培養(yǎng)72 h，利用Caspase3 試劑盒檢測四組Caspase3活性，四組Caspase3活性比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=12.983，P=0.002)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-34a 組Caspase3陽性細胞個數(shù)[(10.75±2.87)個·mm-2]明顯高于陰性對照組[(3.48±0.74)個·mm-2]，轉(zhuǎn)染HMGB1組Caspase3陽性細胞個數(shù)[(2.46±0.94)個·mm-2]明顯低于共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMGB1組[(6.21±1.74)個·mm-2]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)。

2.3熒光顯微鏡下Y79細胞MDC染色情況不同處理組細胞在RPMI-1640培養(yǎng)液處理Y79細胞72 h后，MDC染色增強，熒光顆粒呈點狀分布在自噬泡附近區(qū)域，由圖2中染色可見，轉(zhuǎn)染miR-34a組可見MDC陽性顆粒明顯增多，共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMGB1組次之，陰性對照組可見極少量MDC陽性熒光顆粒，轉(zhuǎn)染HMGB1組陽性顆粒最少(圖2)。

2.4流式細胞儀檢測MDC陽性率流式細胞儀檢測不同處理組Y79細胞MDC陽性率，四組72 h后Y79細胞陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=102.480，P<0.05)，miR-34a組MDC陽性率(56.94%)明顯高于陰性對照組(2.15%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMGB1組MDC陽性率(43.11%)明顯高于轉(zhuǎn)染HMGB1組(10.32%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

2.5透射電子顯微鏡下觀察各組細胞自噬超微結(jié)構(gòu)透射電子顯微鏡下觀察不同處理組自噬在Y79細胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)改變，可見陰性對照組72 h瘤細胞形態(tài)基本無改變，共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMGB1組可見雙層膜結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)染miR-34a組可見自噬溶酶體結(jié)構(gòu)(圖4)。

圖2Y79細胞MDC染色情況。A：轉(zhuǎn)染miR-34a組；B：共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMGB1組；C：陰性對照組；D：轉(zhuǎn)染HMGB1組

圖3流式細胞儀檢測各組MDC陽性率。A：陰性對照組；B：轉(zhuǎn)染HMGB1組；C：共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMGB1組；D：轉(zhuǎn)染miR-34a組

圖4透射電子顯微鏡觀察不同處理組自噬超微結(jié)構(gòu)(×400)。A：陰性對照組；B：共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMGB1組；C：轉(zhuǎn)染miR-34a組(紅色箭頭：自噬溶酶體；白色箭頭：殘留的消化底物)

3討論

視網(wǎng)膜母細胞瘤是常見的眼內(nèi)惡性腫瘤，目前臨床主要的治療方法有眼球摘除、化療及放療，然而以上治療方式對患者影響較大，對患者的生活造成極大的不便[7-8]?；蛑委熥鳛橐环N新的治療方式目前尚處于研究探索階段[9]，miR-34家族是一類高度保守的miRNA，主要有miR-34a、miR-34b、miR-34c三種。其中miR-34a主要在腦內(nèi)表達，季青山等[10]研究表明，在腫瘤細胞中miR-34a的表達量明顯下降。有研究指出，miR-34a是p53介導(dǎo)的抗腫瘤過程中重要環(huán)節(jié)，p53可激活miR-34a發(fā)揮抗腫瘤作用，而miR-34a可通過正反饋上調(diào)p53增強抗腫瘤作用[11]。HMGB1具有穩(wěn)定染色質(zhì)及調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的功能，動物實驗表明，敲除HMGB1后，幼鼠很快死亡[12]。并有報道指出，在多種腫瘤中都發(fā)現(xiàn)HMGB1與腫瘤的發(fā)展及浸潤存在聯(lián)系，抑制HMGB1通路可有效抑制細胞增殖及侵襲[13]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，自噬在腫瘤治療中可發(fā)揮重要作用，自噬能清除細胞內(nèi)的致癌物質(zhì)及受損的細胞，穩(wěn)定細胞內(nèi)環(huán)境、清除細胞垃圾，促進細胞生長及代謝[14-15]。既往研究指出，細胞自噬功能的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切聯(lián)系，腫瘤細胞的自噬能力低于正常組織細胞[16]，這提示，細胞自噬能力的降低可能對腫瘤的發(fā)展有利。miR-34a正反饋作用與細胞自噬作用均具有抗腫瘤作用，目前國內(nèi)外已有利用兩種途徑抑制腫瘤細胞增殖的研究[17-18]，但兩者對視網(wǎng)膜母細胞瘤的研究較少，且miR-34a對自噬功能是否具有調(diào)節(jié)作用的報道也較少。因此，本研究通過miR-34a及HMGB1轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜母細胞瘤，觀察其對自噬的影響并探討其機制。

本研究結(jié)果顯示：RT-PCR檢測miR-34a的轉(zhuǎn)染率，轉(zhuǎn)染miR-34a后，miR-34a的表達明顯升高，高于其他三組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMGB1后，miR-34a表達下降。Caspase3是一種蛋白酶，其是細胞凋亡過程中最重要的剪切酶，同時也是CTL細胞殺傷的重要組成部分[19]。Caspase3活性檢測顯示：轉(zhuǎn)染miR-34a組Caspase3活性最高，轉(zhuǎn)染HMGB1組活性最低，而共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMGB1后Caspase3活性呈上升趨勢，提示轉(zhuǎn)染HMGB1后可降低Caspase3的活性，增強腫瘤的浸潤及發(fā)展。通過本研究結(jié)果可以得出，轉(zhuǎn)染miR-34a可提高機體對腫瘤的抑制作用，miR-34a可能通過抑制HMGB1的表達提高抗腫瘤活性。

MDC是一種可在分子水平檢測自噬發(fā)生情況的方法，其在細胞內(nèi)可被細胞中酸性成分結(jié)合并聚集在自噬囊膜周圍，因此可根據(jù)MDC的熒光強度及熒光顆粒的數(shù)量分析自噬的活化情況[20-21]。本研究中，通過熒光顯微鏡及流式細胞儀檢測MDC，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-34a組可見MDC陽性顆粒明顯增多，共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMGB1組次之，陰性對照組可見極少量MDC陽性熒光顆粒，轉(zhuǎn)染HMGB1組最少。流式細胞儀檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-34a組MDC陽性率明顯高于其余三組，轉(zhuǎn)染HMGB1組MDC陽性率最低，共轉(zhuǎn)染組居中。這提示，miR-34a可提高細胞自噬能力，其在體內(nèi)發(fā)揮作用的途徑可能通過抑制HMGB1的表達來實現(xiàn)。通過透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)，陰性對照組自噬泡未見明顯改變，共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMGB1組自噬泡的出現(xiàn)早于Y79細胞核的改變并出現(xiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)，miR-34a轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)自噬溶酶體囊膜，說明miR-34a可以誘導(dǎo)視網(wǎng)膜母細胞瘤發(fā)生自噬，該結(jié)果與Wu等[20]研究結(jié)果一致，同樣與本研究流式細胞儀檢測結(jié)果相符。

綜上所述，本研究結(jié)果表明通過上調(diào)miR-34a能夠降低視母細胞瘤的增殖，并通過觀察HMGB1轉(zhuǎn)染情況，推測miR-34a在體內(nèi)可能通過抑制HMGB1的表達提高細胞的自噬能力，從而提高抗腫瘤作用，也為我們以后制定抗腫瘤方案提供有力的理論基礎(chǔ)。