鮮靖蘋 柴澍杰 王 勇 ?？e 董文科 馬暉玲 張 然

(1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅蘭州 730070；2新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453000)

鎘(Cd)是生物毒性最強(qiáng)的重金屬元素之一，是僅次于汞的第二大環(huán)境污染源。Cd會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害，且極易被植物吸收，并通過(guò)食物鏈富集對(duì)人體產(chǎn)生慢性中毒[1]。近年來(lái)，由于工礦三廢的排放、無(wú)機(jī)化肥的過(guò)量使用，導(dǎo)致有毒重金屬在土壤中過(guò)量積累，嚴(yán)重污染環(huán)境，對(duì)人類健康造成巨大威脅[2]。因此，對(duì)重金屬Cd的治理刻不容緩。與傳統(tǒng)的化學(xué)、物理等重金屬污染的治理方法相比，植物修復(fù)具有成本低、環(huán)境友好和清除徹底等明顯優(yōu)勢(shì)，是一種有效清除重金屬污染的新興技術(shù)，也是極具潛力的重金屬污染治理手段[3]。然而，現(xiàn)有Cd超富集植物的部分缺陷限制了其在Cd污染治理中的應(yīng)用，如繁殖較差、生物量小等[4]。因此，篩選出具有較強(qiáng)抗Cd性、生物量大、適應(yīng)性廣，且能夠多次刈割的植物材料對(duì)生態(tài)修復(fù)具有重要意義。

草坪草具有生命力旺盛、繁殖和再生能力強(qiáng)，以及分布范圍廣、多年生和抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[5]。研究發(fā)現(xiàn)草坪草作為植物修復(fù)材料，在修復(fù)重金屬污染土壤方面較其他植物具有顯著的優(yōu)越性:一方面，草坪草不會(huì)進(jìn)入食物鏈對(duì)人類健康造成隱患；另一方面，草坪草可以多次刈割，能夠較好地達(dá)到治理重金屬污染的目的[6]。草地早熟禾(Poa pratensisL.)是多年生冷季型草坪草，具有耐修剪、耐踐踏、綜合抗病力強(qiáng)和較好的抗寒抗旱性等特點(diǎn)，被廣泛用于城市園林綠化、高爾夫球場(chǎng)發(fā)球臺(tái)、球道和其他運(yùn)動(dòng)場(chǎng)地建植[5-6]，是常見(jiàn)的冷季型草坪草種之一。目前，前人研究主要集中在對(duì)草地早熟禾的耐鹽堿性及水肥管理等方面[7]，而關(guān)于草地早熟禾在重金屬脅迫方面的生理響應(yīng)和耐性方面的研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)以國(guó)內(nèi)廣泛種植的草地早熟禾品種8份及2個(gè)采集于甘肅省境內(nèi)的野生早熟禾為參試材料，研究Cd脅迫下草地早熟禾幼苗生長(zhǎng)和生理響應(yīng)，通過(guò)評(píng)價(jià)參試材料的Cd脅迫耐受性，篩選出耐Cd的草地早熟禾種質(zhì)材料，以期為土壤Cd污染的治理及生態(tài)環(huán)境保護(hù)提供有效措施及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及來(lái)源

供試10份早熟禾材料中，8份商用品種均購(gòu)自北京克勞沃種子公司，2份野生材料于2015年分別采自甘肅省清水縣和甘肅省秦州區(qū)(表1)。

表1 供試早熟禾材料及來(lái)源Table1 Kentucky bluegrass materials and their sources

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇顆粒飽滿，大小一致的種子，去掉其中雜質(zhì)，用0.1%KMnO4溶液浸泡30 min，再用去離子水沖洗數(shù)次，晾干水分。將處理后的種子直接播入以蛭石為基床、直徑10 cm育苗缽中，參照韓建國(guó)等[8]的方法進(jìn)行萌發(fā)，期間用1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培育，每5 d更換一次。當(dāng)草地早熟禾幼苗生長(zhǎng)50 d后，共設(shè)置4個(gè)濃度梯度 Cd(CdCl2·2.5H2O)處理(0、200、400 和 600 μmol·L-1)，以 0 μmol·L-1Cd 為對(duì)照(CK)，每處理重復(fù)3次。7 d后分別稱取各處理葉片5 g，蒸餾水洗凈，迅速放入液氮中冷凍，-80℃保存用于相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 測(cè)定目標(biāo)與方法

1.3.1 葉片相對(duì)含水量的測(cè)定 參照張志良等[9]的方法并稍加改進(jìn)，剪下完全展開(kāi)的葉片，擦干表面雜質(zhì)，迅速稱量鮮重(fresh weight，Wf)；將葉片浸泡于去離子水中，遮光靜置6～8 h，取出后濾紙吸干表面水分，迅速放入已知重量的鋁盒稱量葉片飽和重(saturated weight，Wt)；105℃殺青 30 min，80℃烘干至恒重，稱量干重(dry weight，Wd)，按照公式計(jì)算葉片相對(duì)含水量(relative water content，RWC):

1.3.2 干物質(zhì)含量的測(cè)定 將鋁盒置于100～105℃烘箱中烘至恒重(2 h)，稱其重量(m0)；隨機(jī)選取早熟禾幼苗20株，用去離子水沖洗，剪碎、混勻后放入上述鋁盒中稱重(m1)。將裝有幼苗樣品的鋁盒置于50～60℃烘箱(鼓風(fēng))中3～4 h，然后放入100～105℃烘箱(不鼓風(fēng))中3～4 h進(jìn)一步恒重，重復(fù)3次，冷卻后稱重(m2)，按照公式計(jì)算植物樣品干物質(zhì)含量:

1.3.3 光合色素含量的測(cè)定 參照張志良等[9]的方法并稍加改進(jìn)。稱取新鮮葉片0.2 g，剪碎后放入離心管中，用8 mL 95%乙醇浸提48 h，利用 MAPADAV-1800紫外分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)分別于665、649和470 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，按照公式分別計(jì)算葉綠素和類胡蘿卜素含量:

式中，Ca:葉綠素 a濃度；Cb:葉綠素 b濃度；C葉綠素:葉綠素濃度；C類胡蘿卜素:類胡蘿卜素濃度；V:提取液體積(L)；W:稱取樣品質(zhì)量(g)。

1.3.4 鎘含量的測(cè)定及轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)的計(jì)算 測(cè)定地上部、地下部生物量后，取出部分烘干樣品稱重，置于LE4/11/R6馬弗爐[納傅熱(上海)工業(yè)爐有限公司]中490℃灰化處理8 h，冷卻后取出灰化的樣品，用王水消煮至澄清，過(guò)濾、定容，利用AA-7000型火焰/石墨爐原子吸收分光光度計(jì)原子吸收分光光度計(jì)(北京東西分析儀器有限公司)采用火焰法測(cè)定溶液中的Cd濃度，地上部、地下部的Cd富集濃度以樣品單位干重表示，并根據(jù)公式計(jì)算Cd的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù):

1.4 生理指標(biāo)的測(cè)定

1.4.1 酶活性測(cè)定 1)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性:采用氮藍(lán)四唑法(nitroblue tetrazolium，NBT)[9]進(jìn)行測(cè)定。反應(yīng)液總體積為4 mL，反應(yīng)介質(zhì)為50 mmol·L-1pH值7.8磷酸緩沖液，含0.2 mL 20 mg·mL-1L-甲硫氨酸、0.2 mL 1 mg·mL-1EDTANa2、0.2 mL 0.1 mg·mL-1核黃素、0.2 mL 1 mg·mL-1NBT、0.1 mL提取酶液(空白管加磷酸緩沖液0.1 mL)，放入透明度好的離心管中，溫度 25℃，置于4 000 lx光強(qiáng)下光照20 min(調(diào)零管用黑布罩上避光)，然后于560 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色，以抑制NBT光化還原50%的酶量為1個(gè)酶活單位。

2)過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)活性:采用愈創(chuàng)木酚法[9]進(jìn)行測(cè)定。以每分鐘內(nèi)A470變化0.01為1個(gè)酶活性單位(U)。

3)過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)活性:采用紫外分光光度法[9]進(jìn)行測(cè)定。以每克鮮重(FW)樣品每分鐘吸光度變化0.001為1個(gè)過(guò)氧化氫酶活性單位(V)。

1.4.2 脯氨酸含量測(cè)定 游離脯氨酸(proline，Pro)含量測(cè)定采用酸性茚三酮法[9]。稱取葉片0.2 g，剪碎置于試管中，向試管中加入5 mL 3%磺基水楊酸，沸水浴中加熱10 min(不斷搖動(dòng))，冷卻后過(guò)濾至干凈試管中(濾液為提取液)。吸取2 mL提取液、2 mL冰醋酸和2 mL酸性茚三酮于具塞玻璃試管中，沸水浴反應(yīng)40 min，冷卻后向試管中加入5 mL甲苯，充分振蕩，靜置分層后，在520 nm處比色(以甲苯為對(duì)照)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照公式計(jì)算脯氨酸含量(μg·g-1FW):

式中，X為標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得脯氨酸含量(μg)。

1.4.3 丙二醛含量測(cè)定 稱取植物葉片1 g，加入2 mL 10%三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)和少量石英砂，研磨至勻漿，然后加入8 mL 10%三氯乙酸進(jìn)一步研磨，定容，4 000 r·min-1離心 10 min，吸取 2 mL 上清液于10 mL具塞玻璃試管中，加入2 mL 0.6%硫代巴比妥酸溶液，搖勻后沸水浴反應(yīng)10 min，取出試管迅速冷卻，4 000 r·min-1離心 10 min，取上清液，分別于532、450和600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度[9]，按照公式計(jì)算丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量(μmol·g-1FW):

1.5 數(shù)據(jù)處理

按照公式計(jì)算指標(biāo)相對(duì)值、單項(xiàng)指標(biāo)耐Cd系數(shù)(ω)[10]:

采用 SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析；Microsoft Excel 2010繪制圖表；綜合評(píng)價(jià)方法采用標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)賦予權(quán)重法。

數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化:運(yùn)用隸屬函數(shù)平均值(D值)法[11]，對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，計(jì)算公式如下:

式中，Xj為指標(biāo)測(cè)定值；Xmin和Xmax分別為所有參試材料某一指標(biāo)的最小值和最大值；指標(biāo)與耐Cd性呈正相關(guān)用公式(15)，指標(biāo)與耐Cd性呈負(fù)相關(guān)用公式(16)[11]。

綜合評(píng)價(jià)值:按照公式計(jì)算各材料各性狀隸屬值的平均值(D值):

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd脅迫對(duì)早熟禾相對(duì)干物質(zhì)含量及葉片相對(duì)含水量的影響

由表2可知，同一Cd濃度處理下，10種早熟禾材料相對(duì)干物質(zhì)含量存在顯著差異。200 μmol·L-1Cd處理下，各參試材料的相對(duì)干物質(zhì)含量為77.57%～98.40%，僅9號(hào)材料的相對(duì)干物質(zhì)含量低于80%；1、2、7、8和10號(hào)材料的相對(duì)干物質(zhì)含量均較高。Cd濃度為400和600 μmol·L-1時(shí)，對(duì)各早熟禾材料相對(duì)干物質(zhì)含量變化范圍分別為69.95%～91.80%和60.70%～86.04%。表明隨著Cd處理濃度的增加，各參試材料相對(duì)干物質(zhì)含量均呈明顯的下降趨勢(shì)，尤其是7號(hào)材料，由 97.50%下降至 72.01%，降幅為25.48%，而1、2、8和10號(hào)材料仍表現(xiàn)出較高的相對(duì)干物質(zhì)含量。此外，不同Cd濃度處理下，9號(hào)材料的相對(duì)干物質(zhì)含量均為最低。

植物葉片相對(duì)含水量是植物組織水分狀況的重要指標(biāo)，在對(duì)植物的抗性研究中發(fā)揮著重要的作用[12]。由表2 可知，200 μmol·L-1Cd 處理下，4、7 和 5 號(hào)材料葉片相對(duì)含水量均較高，2、3和 10號(hào)次之。400 μmol·L-1Cd處理下，各參試材料的葉片組織含水量均有所下降，但4、7和10號(hào)的相對(duì)含水量下降不明顯。600 μmol·L-1Cd處理下，除10號(hào)材料外，其他參試材料均表現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì)。其中，8號(hào)材料降幅最為明顯，下降34.1%，10號(hào)材料僅下降了1.8%，說(shuō)明其具有較強(qiáng)的耐Cd性。結(jié)果表明，Cd濃度與葉片相對(duì)含水量呈顯著負(fù)相關(guān)，在相對(duì)葉片含水量上耐Cd性最強(qiáng)的材料為10號(hào)，8號(hào)材料的耐Cd性最差。

表2 Cd脅迫對(duì)早熟禾相對(duì)干物質(zhì)含量和葉片相對(duì)含水量的影響Table2 Effect of different concentrations of Cd on dry matter content and leaf water content of Kentucky bluegrass/%

2.2 Cd脅迫下10個(gè)早熟禾材料光合色素差異

光合色素含量直接關(guān)系到作物的光合作用效率及產(chǎn)量，其中葉綠素和類胡蘿卜素含量是反映光合色素的重要指標(biāo)[13]。 由表3可知，200 μmol·L-1Cd處理下，相對(duì)葉綠素含量和相對(duì)類胡蘿卜素含量均有所降低，降幅分別在75.98%～96.01%和85.31%～99.08%之間；1、5、6和10號(hào)參試材料的相對(duì)葉綠素含量均較高；1號(hào)和3號(hào)的相對(duì)類胡蘿卜素含量值均較高，其中10號(hào)葉綠素含量和類胡蘿卜素含量均較高。隨著Cd處理濃度的升高，各早熟禾材料的相對(duì)葉綠素和類胡蘿卜素含量均表現(xiàn)出較大幅度的下降，400 μmol·L-1Cd處理下，降幅分別在63.67%～87.53%和79.12%～96.41%之間；600 μmol·L-1Cd 處理下，葉綠素和類胡蘿卜素含量降幅分別在42.54%～82.11%和47.43%～90.95%之間；400 和 600 μmol·L-1Cd 處理下，1、5 和10號(hào)材料的相對(duì)葉綠素和相對(duì)類胡蘿卜素含量均較高。此外，8號(hào)材料的相對(duì)葉綠素和相對(duì)類胡蘿卜素含量隨著Cd處理濃度的增加均呈明顯下降趨勢(shì)，分別下降了49.41%和51.01%，說(shuō)明其耐Cd性較差。

2.3 Cd脅迫下綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)的耐Cd系數(shù)

由表4可知，由各參試材料干物質(zhì)含量計(jì)算得到的耐Cd系數(shù)變幅在0.69～0.92之間，其中2號(hào)和8號(hào)材料的耐Cd系數(shù)較大，9號(hào)材料耐Cd系數(shù)最??；各參試材料葉片相對(duì)含水量計(jì)算得到的耐Cd系數(shù)變化幅度較小，在0.80～0.97之間，其中10號(hào)材料的耐Cd系數(shù)最大，8號(hào)材料的耐Cd系數(shù)最?。挥筛鲄⒃嚥牧先~綠素含量計(jì)算得到的耐Cd系數(shù)中，1號(hào)材料最大，3號(hào)材料最小為0.77；由各參試材料類胡蘿卜素含量計(jì)算得到的耐Cd系數(shù)中，1號(hào)和5號(hào)材料均達(dá)到0.95，8號(hào)材料最小，低于0.80。結(jié)果表明，不同材料相同指標(biāo)下的耐Cd系數(shù)差異顯著(P＜0.05)，相同材料在不同指標(biāo)下的耐Cd系數(shù)也存在差異。利用單項(xiàng)指標(biāo)方法反映不同材料的耐Cd性，結(jié)果不夠準(zhǔn)確，因此本研究采用隸屬函數(shù)法[14]，進(jìn)一步對(duì)參試材料的多項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

表3 Cd脅迫對(duì)早熟禾葉綠素含量、類胡蘿卜素含量的影響Table3 Effect of different concentrations of Cd on chlorophyll content and carotenoid content /%

表4 10份早熟禾材料在Cd脅迫下綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)的耐Cd系數(shù)Table4 Cd-tolerance coefficient of comprehensive evaluation indexes of 10 Kentucky bluegrass materials

2.4 模糊隸屬函數(shù)法對(duì)早熟禾耐Cd性綜合評(píng)價(jià)

采用標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)賦予權(quán)重法，計(jì)算10份早熟禾材料苗期的綜合評(píng)價(jià)D值。由表5可知，D值的變化范圍為0.17～0.59，1、5、6和10號(hào)材料的D 值均在0.45以上，說(shuō)明其綜合評(píng)價(jià)最優(yōu)，其中5號(hào)材料清水和10號(hào)材料午夜的耐 Cd性最強(qiáng)，D值分別為0.50和0.59；D 值在 0.40～0.45 之間的材料有 2、3、4、6 和 7號(hào)，屬中等耐Cd性材料；D值在0.40以下的材料為8號(hào)和9號(hào)，分別是商用品種橄欖球2號(hào)和采自天水的野生材料秦州，屬于耐Cd性較差的材料。

表5 10份早熟禾材料苗期耐Cd性綜合評(píng)價(jià)Table5 Comprehensive evaluation of Cd tolerance of 10 Kentucky bluegrass materials at seedling stage

2.5 Cd在10份草地早熟禾材料體內(nèi)分布和積累特性的研究

由表6可知，隨著Cd濃度的增加，10份材料地上部和根系的Cd濃度和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)均隨之增大，且地上部Cd濃度增加的幅度較根系大。相同Cd處理水平下，地上部Cd濃度最高的為10號(hào)材料，5號(hào)和7號(hào)次之，8號(hào)和9號(hào)地上部的Cd濃度較低；根系Cd濃度最高為10號(hào)材料，1號(hào)和5號(hào)次之，8號(hào)較低，9號(hào)最低。200 μmol·L-1Cd處理下，10份材料的地上部 Cd濃度較根系低，轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)均小于 1；400 μmol·L-1和 600 μmol·L-1Cd處理下，10份材料中除8號(hào)材料外，轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)均大于 1，即地上部 Cd濃度高于根系；400 μmol·L-1Cd處理下，5、7和10號(hào)材料的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)均達(dá)到1.50以上，1和9號(hào)材料轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)均較低，且均小于 1.20，8 號(hào)材料的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)為 0.98；600 μmol·L-1Cd處理下，3、5和7號(hào)材料的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)均達(dá)到1.60以上，其中1號(hào)材料的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)最低，8和9號(hào)材料的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)也較低，分別為1.12和1.15。

2.6 Cd脅迫對(duì)早熟禾葉片中SOD、POD、CAT活性的影響

SOD是植物體內(nèi)清除氧自由基的一種重要的保護(hù)酶[15]。由圖1-A可知，Cd脅迫對(duì)草地早熟禾種質(zhì)材料SOD活性影響顯著。方差分析結(jié)果表明，10種早熟禾材料的SOD活性在不同濃度Cd脅迫下均呈顯著下降趨勢(shì)(P＜0.05)。 200 μmol·L-1Cd 處理下，8 號(hào)和9號(hào)材料的降幅較大，分別為44.4%和30.3%，其他材料降幅均在25.5%以下。隨著Cd處理濃度的升高，各參試材料SOD活性下降幅度在25.45%～63.62%之間，且均存在差異。 400和 600 μmol·L-1Cd處理下，8號(hào)材料的降幅分別為49.42%和53.99%；9號(hào)材料的降幅分別為51.06%和63.62%。結(jié)果表明，隨著Cd脅迫濃度的升高，1、5、6和10號(hào)材料SOD活性的降幅均較小，說(shuō)明上述4種材料的耐Cd性均較強(qiáng)；8號(hào)和9號(hào)材料降幅較大，說(shuō)明其耐Cd性較差。

由圖1-B可知，10種材料葉片的POD活性均隨著Cd脅迫濃度的增加而降低，且差異較大。200 μmol·L-1Cd處理下，1號(hào)和6號(hào)材料的降幅均較大，分別為28.65%和37.48%，其他材料降幅在4.06%～25.6%之間；400 μmol·L-1Cd處理下，4號(hào)和 8號(hào)材料的降幅分別為50.65%和55.04%，其他材料的降幅均在50%以下；600 μmol·L-1Cd 處理下，8 號(hào)和 9 號(hào)材料的降幅均達(dá)到 83.6%，其他材料降幅在 21.9%～57.4%之間，結(jié)果表明，高濃度的Cd脅迫下，各參試材料的POD活性降幅均明顯增加，其中耐Cd性強(qiáng)的材料降幅較小，而耐Cd性差的材料降幅較大。10號(hào)材料POD活性在400和600 μmol·L-1Cd脅迫下的降幅均最小，說(shuō)明10號(hào)材料午夜表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐Cd性。

由圖1-C可知，隨著Cd處理濃度的增加，5號(hào)和10號(hào)材料CAT活性的下降幅度均較小，降幅在3%以下；8號(hào)和9號(hào)材料的CAT活性均下降明顯，且與其他材料差異顯著。各供試材料的CAT活性和SOD活性的變化趨勢(shì)相同，表明二者具有一定的協(xié)同作用。CAT和SOD清除氧自由基的反應(yīng)機(jī)理上也證實(shí)了此結(jié)果，SOD消除氧負(fù)離子的反應(yīng)最終生成H2O2，而CAT利用生成的H2O2反應(yīng)生成H2O和O2，以達(dá)到清除活性氧的目的[16]。

表6 10種早熟禾材料地上部和根系的Cd濃度Table6 The concentration of Cd in 10 Kentucky bluegrass materials shoots and roots

2.7 Cd脅迫對(duì)早熟禾葉片中脯氨酸及MDA含量的影響

脯氨酸含量的變化是反映植物在逆境脅迫下生理適應(yīng)的指標(biāo)之一。研究發(fā)現(xiàn)植物體內(nèi)氨基酸代謝與脯氨酸含量變化密切相關(guān)，因此脯氨酸含量還可作為反映氨基酸代謝是否發(fā)生障礙的指標(biāo)[17]。由圖2可知，與對(duì)照相比，10種早熟禾材料的脯氨酸含量均隨著Cd處理濃度的增加而逐漸降低，說(shuō)明Cd脅迫在一定程度上對(duì)植株幼苗產(chǎn)生了傷害。200 μmol·L-1Cd處理下，1、2、5和10號(hào)材料脯氨酸含量的降幅均較小(22%以下)；Cd 處理濃度由 400 μmol·L-1增加到 600 μmol·L-1時(shí)，10號(hào)材料脯氨酸含量的下降趨勢(shì)較平緩，但與其他材料差異顯著，說(shuō)明10號(hào)材料在脯氨酸含量上表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐Cd性；而4、8和9號(hào)材料脯氨酸含量均下降明顯，說(shuō)明這3種材料抗性較差。

圖1 Cd脅迫對(duì)早熟禾SOD、POD和CAT活性的影響Fig.1 Effect of different concentrations of Cd on the activities of SOD、POD and CAT of 10 Kentucky bluegrass materials

圖2 Cd脅迫對(duì)早熟禾材料脯氨酸含量的影響Fig.2 Effect of different concentrations of Cd on the contents of proline of Kentucky bluegrass

MDA是反映植物在逆境脅迫下膜系統(tǒng)受害程度的重要指標(biāo)之一[18]。由圖3可知，Cd脅迫下，各參試品種的MDA含量均有不同程度的升高；各參試材料在相同濃度的Cd脅迫下，細(xì)胞膜受傷害程度不同，表明其對(duì)Cd脅迫的耐受能力存在材料間差異。200 μmol·L-1Cd處理下，1號(hào)超級(jí)哥來(lái)德和10號(hào)午夜的MDA含量雖然分別升高了5.38%和7.37%，但與其他材料相比變化較小，表現(xiàn)出較高的耐Cd性；而2號(hào)解放、3號(hào)巴潤(rùn)和8號(hào)秦州的MDA含量升高較明顯，分別升高了32.8%，36.5%和50.1%。隨著Cd處理濃度的增加，8號(hào)秦州的MDA含量升高最為明顯，400和600 μmol·L-1Cd處理下分別達(dá)到 62.6%和 80.7%，始終表現(xiàn)出Cd敏感性；而1號(hào)超級(jí)哥來(lái)德和10號(hào)午夜在Cd處理濃度達(dá)到 600 μmol·L-1時(shí)，MDA 含量增幅仍低于24.0%，表現(xiàn)出較好的耐Cd性。

圖3 Cd脅迫對(duì)早熟禾材料MDA含量的影響Fig.3 Effect of different concentrations of Cd on the contents of MDA of Kentucky bluegrass

3 討論

3.1 Cd脅迫對(duì)早熟禾幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)和光合色素的影響

研究表明，當(dāng)Cd濃度超過(guò)植物的耐受水平時(shí)，植物生長(zhǎng)會(huì)受到嚴(yán)重抑制，表現(xiàn)出植株矮小、葉片失綠、根系死亡、地上地下生物量減小等癥狀，直觀反映出植物受到Cd脅迫后的毒害程度[19-20]。楊麗等[14]研究表明，高濃度的Cd對(duì)披堿草的地上生物量、葉片相對(duì)含水量等指標(biāo)有顯著的抑制作用，這與本研究結(jié)果一致。高濃度的重金屬脅迫會(huì)抑制細(xì)胞葉綠素合成酶的活性，同時(shí)通過(guò)增加葉綠素酶的活性，加速植物體內(nèi)葉綠素的分解，導(dǎo)致葉綠素含量降低[21]。劉大林等[22]研究發(fā)現(xiàn)高濃度的Cd、鉛脅迫均會(huì)導(dǎo)致草地早熟禾葉綠素含量降低，這與本研究結(jié)果相同。

研究發(fā)現(xiàn)過(guò)量的重金屬Cd會(huì)抑制草地早熟禾的生長(zhǎng)和發(fā)育、干擾細(xì)胞的正常代謝過(guò)程，并引起一系列的生理變化[21]。本研究利用與逆境脅迫相關(guān)的干物質(zhì)含量、葉片相對(duì)含水量、葉綠素含量和類胡蘿卜素含量4項(xiàng)指標(biāo)的變化來(lái)分析Cd脅迫下草地早熟禾的生長(zhǎng)狀況。通過(guò)計(jì)算不同指標(biāo)與CK相比得到的指標(biāo)相對(duì)值，再根據(jù)函數(shù)方程計(jì)算出耐Cd系數(shù)，同時(shí)為消除單個(gè)指標(biāo)判斷的片面性，運(yùn)用模糊隸屬函數(shù)平均(D值)法進(jìn)行抗Cd性的綜合評(píng)價(jià)，使各參試材料的耐Cd性差異更具可比性，初步篩選出10號(hào)材料午夜為耐Cd品種，8號(hào)材料橄欖球2號(hào)為Cd敏感材料。

3.2 Cd脅迫早熟禾幼苗質(zhì)膜過(guò)氧化和細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

植物器官在逆境條件下會(huì)發(fā)生脂膜過(guò)氧化作用。MDA是脂膜過(guò)氧化作用的最終產(chǎn)物，是反映植物在逆境脅迫下膜系統(tǒng)受害的重要指標(biāo)，其含量越高說(shuō)明細(xì)胞膜受到的傷害程度越嚴(yán)重[23]。本研究中，10號(hào)材料MDA含量的升高并不顯著，600 μmol·L-1Cd處理下，MDA含量的增幅仍在24.0%以下；不同濃度Cd脅迫下，8號(hào)材料MDA含量均呈明顯的上升趨勢(shì)，400和600 μmol·L-1Cd處理下分別達(dá)到62.6%和80.7%，且與其他材料差異顯著。表明10號(hào)材料表現(xiàn)出較好的抗Cd性，而8號(hào)材料對(duì)Cd則比較敏感。

植物體內(nèi)有多種滲透調(diào)節(jié)類物質(zhì)，如脯氨酸、可溶性糖、甜菜堿等，這些細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)維持細(xì)胞平衡起著非常重要的作用[24]。脯氨酸是植物蛋白質(zhì)的組分之一，以游離狀態(tài)廣泛存在于植物體中，在逆境條件下，植物體內(nèi)脯氨酸含量會(huì)顯著增加，當(dāng)傷害達(dá)到一定程度時(shí)，可能導(dǎo)致植株脯氨酸含量下降或植株死亡，因此脯氨酸含量的變化可反映植物的抗逆性[25]。本研究結(jié)果表明，Cd脅迫下，各參試材料的脯氨酸含量與CK相比均呈下降趨勢(shì)，且材料間差異顯著，這可能是由于試驗(yàn)設(shè)計(jì)的最低Cd濃度已經(jīng)超出植物承受范圍所造成的。其中，10號(hào)材料的脯氨酸含量下降趨勢(shì)平緩，與其他材料相比表現(xiàn)出較好的適應(yīng)性；而8號(hào)材料在不同Cd濃度處理下的脯氨酸含量均有所下降，且降幅較大，說(shuō)明其細(xì)胞膜受傷害程度較其他材料嚴(yán)重，對(duì)Cd抗性較差。

3.3 Cd脅迫對(duì)早熟禾幼苗抗氧化酶活性的影響

逆境脅迫下，植物體內(nèi)會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)造成不同程度的植物氧化傷害[26-27]。SOD、CAT、POD是植物清除體內(nèi)過(guò)量的超氧陰離子自由基和過(guò)氧化氫的重要酶類，也是植物適應(yīng)逆境脅迫的植物保護(hù)酶系統(tǒng)[28-29]。研究發(fā)現(xiàn)隨著Cd濃度的增加，植物體內(nèi)的SOD、POD和CAT活性會(huì)明顯增加。吳旭紅等[30]研究苜蓿(Medicago sativaL.)幼苗耐Cd性，發(fā)現(xiàn)隨著Cd濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD和POD活性均呈先升高后降低的趨勢(shì)。陳宏等[31]研究小麥(Triticum aestivumL.)幼苗時(shí)發(fā)現(xiàn)，高濃度的Cd脅迫下，植株體內(nèi)SOD和POD活性均呈下降趨勢(shì)，這與本研究結(jié)果一致。說(shuō)明植物對(duì)Cd的毒性效應(yīng)調(diào)控存在一定濃度閾值[32-33]，調(diào)控能力隨著Cd濃度的升高而減弱，低濃度的Cd刺激草地早熟禾的抗氧化酶活性增強(qiáng)，這可能與植物自我保護(hù)機(jī)制[34]有關(guān)。本研究中，在一定濃度的Cd處理下，草地早熟禾能夠更好地調(diào)節(jié)體內(nèi)抗氧化酶活性來(lái)抵御Cd傷害，而當(dāng)濃度超過(guò)植物自身調(diào)控閾值，酶活性就會(huì)表現(xiàn)出下降趨勢(shì)。

3.4 早熟禾材料對(duì)Cd的積累能力

本研究發(fā)現(xiàn)10種草地早熟禾的地上部和根系積累了大量Cd。研究表明，200 mg·kg-1Cd處理下，超積累植物龍葵(Solanum nigrum)地上部分和根系的Cd濃度分別達(dá)到57.2和41.9 mg·kg-1DW[35]；Cd積累植物錦葵(Malva sinensis)地上部和根系的Cd濃度分別達(dá)到154.3和92.2 mg·kg-1DW[36]；Cd積累植物蒲公英(Taraxacum mongolicum)在 100 mg·kg-1Cd處理下其根系和地上部Cd濃度分別達(dá)到157.4和167.2 mg·kg-1DW[37]。本研究中，10份草地早熟禾材料地上部分和根系Cd濃度隨著處理濃度的增加而增加，在相同Cd濃度處理下，地上部Cd濃度最高的是10號(hào)材料，5號(hào)和7號(hào)次之，8號(hào)和9號(hào)較低。根系Cd濃度最高是10號(hào)材料。 400 μmol·L-1Cd 處理下，10 號(hào)、5號(hào)和7號(hào)材料的地上部和根系Cd濃度分別達(dá)到2 115.6 和1 399.2、1 992.7 和1 300.8、1 570.9和998.7 μmol·L-1。表明10份早熟禾材料中10號(hào)、5號(hào)和7號(hào)材料地上部和根系對(duì)Cd有較強(qiáng)的積累能力。

4 結(jié)論

隨著Cd處理濃度的升高，10份參試材料苗期干物質(zhì)含量、葉片相對(duì)含水量和葉綠素含量等指標(biāo)與對(duì)照相比均呈顯著下降趨勢(shì)；綜合評(píng)價(jià)篩選出耐Cd材料為10號(hào)午夜，Cd脅迫下10號(hào)材料的抗氧化酶活性和脯氨酸含量均高于其他材料，而MDA含量均低于其他材料，表現(xiàn)出較高的耐Cd性；相同Cd濃度處理下，10號(hào)材料地上部和根系Cd濃度最高，表現(xiàn)出較高的Cd積累能力。本研究結(jié)果為草地早熟禾在重金屬植物修復(fù)方面的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。