宗艾倫，周迎生

(首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，北京市心肺血管疾病研究所，北京 100029)

光學顯微鏡和電子顯微鏡，是研究亞細胞結(jié)構(gòu)最常用的兩大類顯微鏡技術(shù)。光學顯微鏡可根據(jù)光源不同分為普通光、熒光、紅外光顯微鏡等。熒光光學顯微鏡以免疫熒光染色為技術(shù)基礎，以熒光抗體為成像探針只選擇與熒光抗體特異結(jié)合的結(jié)構(gòu)進行成像。

光學顯微鏡分辨率定義為顯微鏡下可分辨兩獨立同亮度理想點光源間的最小距離。因存在衍射，成像為光斑而非理想光點。當兩光點過于靠近，其像斑重疊時，無法將兩點區(qū)分開，即光學系統(tǒng)中存在一分辨率極限。根據(jù)瑞利判據(jù)，光學衍射分辨率極限為 ～ λ/2。熒光光學顯微鏡受光學衍射限制，水平方向上區(qū)分兩個同亮度理想點光源的最小距離200 nm，即～ 200 nm橫向分辨率(488 nm激發(fā)光下)，垂直方向上為500 nm，即～ 500 nm縱向分辨率(488 nm激發(fā)光下)。為了獲得更高分辨率的納米級圖像，超分辨率熒光顯微鏡技術(shù)應運而生。

超分辨率熒光顯微鏡技術(shù)可以突破光學衍射極限，獲得較傳統(tǒng)熒光顯微鏡，如全內(nèi)反射熒光顯微鏡(total internal reflection fluorescence microscope，TIRF)、共聚焦顯微鏡(confocal microscopy，Confocal)等更高的成像分辨率[1]。其中，STORM和STED作為兩種最受關(guān)注的超分辨率熒光顯微鏡技術(shù)，均用于解析細胞納米級圖像，都取得了許多重大應用突破。例如，使用STORM顯示細胞中肌動蛋白、細胞骨架的圖像[2]報道了橫向10 nm，縱向20 nm的分辨率；發(fā)現(xiàn)肌動蛋白和血管細胞在軸突中形成環(huán)狀細胞骨架結(jié)構(gòu)[3]；在BS-C-1活細胞中，STORM可獲得橫向30 nm，軸向50 nm的分辨率[4]；在多色顯像方面，STORM在PtK2 細胞成像中已經(jīng)可支持五種不同的顏色[5]。STED應用中，激發(fā)光需配合相應的損耗激光(STED beam)。在生物樣品中，結(jié)合4Pi顯微鏡報道了約40 nm橫向和縱向分辨率[6]； STED使用于生物樣品上的最高橫向分辨率為20 nm[7]； 此外，STED已經(jīng)可以在活體小鼠大腦中進行成像，獲得70 nm橫向分辨率的長時間神經(jīng)元圖像[8]；使用STED顯示Hep G2 細胞分泌泡胞吐過程中，分泌泡外膜與細胞膜Ω-型半融合結(jié)構(gòu)，報道60 nm橫向， 150 nm縱向分辨率[9]。本文將討論與實施相關(guān)的技術(shù)細節(jié)，重點介紹這些相似和差異對兩種技術(shù)優(yōu)缺點的影響。

1 熒光控制

STORM隨機地激活樣品中部分熒光基團使之處于熒光態(tài)，未被激活的則處于暗態(tài)，而STED有目標地特定激活樣品某一區(qū)域。STORM通常搭建于帶全內(nèi)反射熒光顯微鏡(TIRF)照明器的熒光顯微鏡，利用TIRF光路實現(xiàn)激發(fā)光均勻照明，激發(fā)整個照明視野。此外， TIRF狀態(tài)下的STORM可得到最高定位精度和信噪比。通常基于全內(nèi)反射熒光顯微鏡平臺，其技術(shù)原理大致可分為兩部分：①在一幀圖像里，根據(jù)STORM染料的閃爍特性，隨機激發(fā)的熒光分子信號，拍攝到這些分子的熒光信號，通過高精度計算從每個熒光團信號的亮度中心為坐標確定該熒光信號團的定位。②重復采集多幀(約5000～10 000張)STORM圖像，結(jié)合圖像重建算法對所有圖片上的定位分子進行坐標位置篩選、重建出一張超高分辨率的STORM圖形[10-11]。STED則基于激光掃描共聚焦顯微鏡平臺，其成像原理有賴于共聚焦掃描和檢測光路。激發(fā)光源既可使用脈沖光源也可選擇連續(xù)光源，分辨率受到激發(fā)光束聚焦于樣本上的光斑大小限制。STED通過引入一束環(huán)形損耗光(STED beam，與發(fā)射光波長相近，相位相反)以減小樣本有效熒光光斑面積。STED技術(shù)原理大致可以分為兩部分：①激發(fā)光激發(fā)樣品熒光基團，使熒光基團處于熒光態(tài)，被照亮的熒光區(qū)域稱為艾里斑(Airy disk)。②另外引入的損耗光則生成一個中空圓環(huán)抑制艾里斑周圍熒光強度。使得僅可觀察到艾里斑的中心熒光強度[1]，從而有效地將光斑面積減少，提高分辨率。

2 激光強度

選擇較低功率的激光強度有利于保存樣品生物活性免受光損傷。STORM和STED使用的激光強度均高于傳統(tǒng)熒光顯微鏡。STORM所需的激光功率通常低于STED，擁有更大的活細胞內(nèi)成像潛能[12-14]。激光強度設置對STORM至關(guān)重要?？刂茻晒鈭F在熒光態(tài)和暗態(tài)切換，成像所需的激光強度必須足夠高，以確保能將全部熒光態(tài)基團推回至暗態(tài)。通常在STORM圖像采集過程中的激光強度約為1 kW /cm2(647 nm)[5]。合理設置激發(fā)光強度可提升STORM成像質(zhì)量。STED需要高強度損耗光達到最佳分辨率，分辨率隨損耗光強度增加而增加，理論上不存在極限。在實踐中，限制激光強度的兩個主要因素：一是樣品能承受的最大激光量；二是最大損耗激光強度可傳遞能量的大小。高激光強度不僅對樣品本身產(chǎn)生影響，也加速熒光染料光漂白過程。在活細胞內(nèi)應用時，更應特別注意激光強度的選擇是否會對細胞活力及細胞正常功能產(chǎn)生影響。此外，還需要充分考慮樣本和STED顯微鏡平臺間的綜合影響[15-16]。

3 樣品制備

樣品制備對于顯微鏡技術(shù)至關(guān)重要，主要包括熒光染料選擇及標記、成像緩沖液等。樣品制備流程與常規(guī)免疫熒光染色流程并無差異，只是熒光二抗選擇需符合技術(shù)要求。超分辨率顯微鏡所使用的二抗需更耐光漂白，即上百次反復開關(guān)后不出現(xiàn)明顯衰減。尤其對于STORM，選取有高光吸收效率及靈敏度，高亮度和高對比度，以及高光轉(zhuǎn)換或光激活性質(zhì)的染料，更有利于提高STORM成像質(zhì)量[17]。此外，樣品制備也應遵循減少光漂白的原則，例如應用含有還原劑系統(tǒng)的緩沖液。

對于固定細胞，可使用傳統(tǒng)免疫熒光染色一抗及熒光二抗。隨著熒光技術(shù)發(fā)展，樣品制備的選擇也更豐富。例如，選擇物理尺寸更小的Fab片段或納米抗體等標記方式可進一步提高STORM定位精度[18]?？砷_關(guān)熒光素染料[19-20]等直接用于STORM成像[21]。STED熒光染料選擇需考慮損耗光波長與熒光染料發(fā)射光譜限制。即損耗光波長必須同時滿足既落在熒光染料激發(fā)光譜之外，又落在熒光染料發(fā)射光譜以內(nèi)。除此之外，為使熒光盡可能多得通過檢測器，損耗光波長不應與熒光染料發(fā)射峰值重疊，且向發(fā)射較弱、波長較長側(cè)偏移為佳。適當將STED損耗光向波長較短側(cè)移動可進一步提高分辨率，其原因與透鏡間能量損耗相關(guān)[22]。

4 圖像處理

圖像處理通常由內(nèi)嵌函數(shù)的影像軟件完成。STORM在圖像采集后需大量圖像處理。圖像處理涉及到熒光團鑒定、定位，最終圖像重建。鑒定通常要求熒光團不相互重疊。定位方法最常使用高斯模型近似點擴散函數(shù)，每個熒光團的位置為高斯函數(shù)中心點。熒光團亮度越高，定位結(jié)果越準確。一張超高分辨率STORM圖像可能需要10萬到1000萬個圖像定位點。此外，越來越多算法被開發(fā)用于STORM圖像處理，以減少成像滯后，縮短成像時間[18，23]。

STED在圖像采集后，不再需要額外的圖像數(shù)據(jù)處理。因此，STED圖像產(chǎn)量顯著高于STORM。這一優(yōu)點也極大地提升了STED技術(shù)應用于細胞內(nèi)成像的潛力。

5 圖像采集

STORM成像原理需要在定位10萬至1000萬個圖像定位點基礎上，重建超分辨率圖像。在實際應用中，需要考慮樣品定位漂移。產(chǎn)生樣品定位漂移的原因很多，如成像系統(tǒng)機械穩(wěn)定性，樣品與物鏡間油膜穩(wěn)定程度，溫度等。最終圖像分辨率與定位點數(shù)量正相關(guān)，因此，可以考慮犧牲一定分辨率換取更快的成像速度[4]。例如，實時成像較大結(jié)構(gòu)時，可使用壓縮感應的方法[24]，或采用更亮熒光團結(jié)合更高激光強度[4]，所得STORM圖像采集速度大幅提升，僅需幾秒就可獲得30 nm的空間分辨率，50 nm的橫向分辨率，而縱向成像時間更短，僅需12 s便可獲得50 nm的縱向分辨率。STED圖像采集時間與所使用共聚焦顯微鏡基本一致，通常僅需幾秒。實際圖像采集時間可能因具有更高信噪比和更高空間分辨率而略長于共聚焦顯微鏡。STED已成功報道應用于活體動物大腦120 μm深度切片成像，分辨率為60 ～ 80 nm[25]。結(jié)合雙光子顯微鏡，小鼠腦深部組織切片成像[8，26]?；铙w小鼠大腦中神經(jīng)元長時間成像，并獲得70 nm的分辨率[8]。

雖然STORM和STED都具有活體內(nèi)成像的應用潛力，但從圖像采集時間來看，STED明顯優(yōu)于STORM。

6 解析度

STORM和STED都可以實現(xiàn)超分辨率成像，最終圖像解析度由多個因素共同決定。在STORM中，空間分辨率由探針大小、標記密度和定位精度決定。免疫染色抗體可提供10 ～ 15 nm探針大小。如前所述，STORM已經(jīng)實現(xiàn)了固定細胞內(nèi)橫向10 nm，縱向20 nm的分辨率[1-2]。更換更小物理尺寸的探針可進一步提升分辨率，如探針大小僅4 ～ 6 nm的納米顆粒和Fab片段[18]。此外，標記密度也會影響圖像分辨率，STORM圖像是逐點重建生成，熒光越亮定位精確度越高，如果區(qū)域定位點數(shù)量不夠多，最終重建的圖像分辨率也會降低。STED分辨率與損耗光強度正相關(guān)。在樣品可耐受范圍內(nèi)，選擇盡可能高的損耗激光強度有助于提高分辨率。

在縱向分辨率方面，STORM和STED均已擴展至三維成像階段。實現(xiàn)3D成像最簡單且最具成本效益的方式是使用散光鏡片，可獲得50 ～ 60 nm的縱向分辨率[27]。STED通過兩個不同的相位板將耗損光束分割，再通過相應相位板后重新組合，最終集中到樣品上[28-29]。不僅實現(xiàn)了橫向檢測光點的縮小，也實現(xiàn)了縱向檢測光點尺寸的縮小，從而提高了縱向分辨率。但需要注意的是，因為光束分割的原因，縱向和橫向分辨率是相關(guān)的，提高橫向分辨率會降低縱向分辨率，反之亦然。所以需要根據(jù)實際拍攝樣品及目的來調(diào)整。除此之外，為降低損耗光強度而引入時間門探測技術(shù)(time gated detection)，提出的gSTED。根據(jù)不同熒光染料熒光壽命的不同，有效減小串色、降低圖像背景，去除自發(fā)熒光等影響[30-31]。

總之，STORM擁有更高的分辨率，但圖像采集時間更長的缺點限制了其在活體細胞中的應用。STED生物分辨率雖不及STORM，但對熒光染料兼容更好，采集過程更簡單快速，更具活體成像潛力等特點使其在生物學的應用較STORM廣泛。隨著STED技術(shù)的快速發(fā)展，STED已經(jīng)使得在不損失圖像分辨率的前提下減少所需激光強度成為可能。我們相信隨著超分辨率顯微鏡技術(shù)的不斷突破和進展，STORM和STED都將成為我們揭秘納米級世界的有利工具。

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