王茂春，段維旺，李凱，周宇荀，肖君華

(東華大學(xué)生物研究所，上海 201620)

哺乳動物的肢體發(fā)育是一個自身基因按時空被嚴格調(diào)控表達的過程，涉及細胞增殖、分化、遷徙和凋亡[1-6]。其中，Hox、Fgfs和Shh等信號通路發(fā)揮著重要作用。模式動物的研究表明，這些通路相關(guān)基因突變會造成的肢體發(fā)育缺陷。Hoxd12、13突變小鼠表現(xiàn)出前肢腕骨、掌骨和指骨不同程度的畸形[7-8]。小鼠Hoxa和Hoxd基因簇發(fā)生缺失突變時，小鼠肢體在發(fā)育早期停止發(fā)育，表現(xiàn)出嚴重的肢體遠端組織的缺失，并且Shh的信號通路無法生成[9]。在人類中存在因肢體發(fā)育異常造成的出生缺陷，美國疾病控制中心(CDC)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，在美國每年約有1500 例上肢缺陷和700 例下肢缺陷新生兒，發(fā)病率達到了0.02% ～ 0.04%[10]。對于肢體發(fā)育的研究越來越受到生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的重視。

關(guān)于前后肢發(fā)育是如何被分別調(diào)控的，相關(guān)的研究目前較少。Logan等[11]通過雞胚模型研究表明，將該后肢發(fā)育的信號來源極化活性區(qū)移植到前肢，會誘導(dǎo)異位的后肢結(jié)構(gòu)。已有的文獻表明，通過雞胚和小鼠等模型的研究發(fā)現(xiàn)前后肢的形態(tài)分別受Tbx5/4基因所影響，Tbx5 基因的產(chǎn)物與前肢發(fā)育有關(guān)，而Tbx4 基因產(chǎn)物與后肢的發(fā)育相關(guān)[12-14]。Nemec等[15]研究表明后肢特異表達的Pitx1基因?qū)τ诤笾螒B(tài)的形成起著重要的作用。

本研究通過小鼠前后肢基因表達譜芯片差異基因的聚類分析及信號通路分析，獲得后肢特異表達核心基因，并通過qPCR驗證部分基因，為哺乳動物肢體發(fā)育研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

8周齡SPF級C57BL/6 J小鼠(3只雄鼠，體重24 ～ 26 g；6只雌鼠，體重18 ～ 20 g)，購自上海斯萊克實驗動物有限公司【SCXK(滬)2017-0005】，飼養(yǎng)于東華大學(xué)實驗動物房【SYXK (滬) 2014-0022】，環(huán)境溫度20 ～ 24℃，相對濕度40% ～ 70%，期間給予充足的飼料及潔凈飲用水。小鼠飼料為上海普路騰生物科技有限公司生產(chǎn)的輻照大小鼠繁殖料【滬飼證(2014)04001】。所有動物實驗操作均得到東華大學(xué)實驗動物委員會批準(zhǔn)(編號：東華倫審[2018] 6號)。

1.1.2 主要試劑及儀器

Trizol試劑(Invitrogen公司，美國)，F(xiàn)irst Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司，美國)，SuperReal PreMix Plus qPCR試劑(天根生化科技有限公司，中國)。

Nanodrop 2000c核酸定量儀(Thermo Fisher Scientific公司，美國)，PCR儀(Bio-Rad公司，美國)，7500實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 RNA抽提

實驗鼠采用一雄兩雌的方式合籠，次日清晨通過觀察陰栓判定孕期，如果見栓記為0.5 d，在雌鼠懷孕10.5 d時，使用脊椎脫臼法犧牲母鼠，剖取胎小鼠，使用Trizol試劑抽提胎鼠前后肢胚芽RNA，使用Nanodrop 2000c進行RNA濃度及純度的檢測，RNA保存在-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 芯片數(shù)據(jù)下載

小鼠前后肢基因表達芯片數(shù)據(jù)下載于National Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibus(NCBI GEO)數(shù)據(jù)庫(GSE30138)。

1.2.3 基因表達驗證

采用Thermo Fisher Scientific公司的First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，按照操作說明進行1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄，包括3個前肢胚芽RNA及3個后肢胚芽RNA。使用ddH2O將得到的cDNA進行5倍稀釋。按照下列體系進行qRT-PCR檢測，包括：10 μL SuperReal PreMix Plus，0.4 μL Rox，2.5 μL cDNA模板，300 nmol/L的上下游引物，補水至20 μL，同時設(shè)置陰性對照。采用兩步法PCR反應(yīng)程序進行反應(yīng)：95℃預(yù)變性2 min；95℃ 15 s，62℃ 32 s，40個循環(huán)，每個樣本做3個重復(fù)。結(jié)果使用相對定量的方法進行分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，采用t檢驗進行組間差異統(tǒng)計分析，P< 0.001差異有顯著性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Transcriptome Analysis Console軟件對原始數(shù)據(jù)(5個前肢E10.5 d芯片及4個后肢E10.5 d芯片)進行質(zhì)控，利用差異倍數(shù)為2倍以上或0.5倍以下及P值小于0.05進行數(shù)據(jù)過濾，使用軟件的Volcano Plot及Hierarchical Clustering功能進行差異表達基因的火山圖繪制及聚類分析。根據(jù)聚類分析結(jié)果將后肢特異表達的差異基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫，進行Gene Ontology(GO)功能分析，將后肢特異表達的差異基因?qū)隚eneminia數(shù)據(jù)庫，進行基因分子網(wǎng)絡(luò)繪制。

2 結(jié)果

2.1 小鼠前后肢差異表達基因及功能分析

為了了解哺乳動物前后肢基因表達譜差異及差異基因的生物學(xué)功能，我們首先將芯片數(shù)據(jù)進行質(zhì)量檢查及標(biāo)準(zhǔn)化，對比分析前肢及后肢組間差異表達的基因。差異基因分析結(jié)果如圖1所示，以差異倍數(shù)為2倍以上或0.5倍以下及P值小于0.05進行數(shù)據(jù)過濾，小鼠胚胎E10.5 d后肢相較于前肢差異表達的基因共有275個：其中紅色的點表示上調(diào)的基因，共45個；藍色的點表示下調(diào)的基因，共230個。將差異基因列表導(dǎo)入David數(shù)據(jù)庫，進行GO分析，結(jié)果如表1所示，這些差異表達的基因主要涉及基因的轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)控、多器官的發(fā)育、骨骼系統(tǒng)的發(fā)育、細胞粘連和細胞分化等方面的功能。

表1 差異表達基因參與的前15個生物過程Table 1 Top 15 biological processes involving the differentially expressed genes

圖1 前后肢差異表達基因的火山圖Figure 1 Volcanic map of the differentially expressed genes in the fore and hind limbs

2.2 聚類分析

為了進一步確認后肢特異表達的基因，我們將差異表達的基因進行了層次聚類分析。層次聚類分析結(jié)果如圖2所示，我們可以看到前后肢差異表達基因可以分為4個cluster， cluster 1顯示前肢和后肢表達量都較高，cluster 2顯示前肢和后肢表達量都較低，cluster 3顯示前肢表達量較高，后肢表達量較低，cluster 4顯示后肢表達量高，前肢表達量低。同一天相較于前肢，后肢在特異表達的基因?qū)τ诤笾l(fā)育起到更突出的作用。

2.3 分子網(wǎng)絡(luò)圖

為了了解后肢特異表達的差異基因在分子層面相互作用關(guān)系，我們通過聚類分析，將cluster 4僅在后肢特異表達的基因進行基因相互作用分子網(wǎng)絡(luò)圖的繪制(圖3)。共表達前十個基因為：Upk3b、Aldh1a2、Hoxb9、Hoxc9、Tcf3、Gata6、Prrx2、Crmp1、Pitx1、Agrp；基因相互作用核心節(jié)點前十個基因：Ifi204、Skor1、Tle1、Rxra、Rarb、Lhx3、Ldb1、Lbx1、Isl1、Gata6。

圖2 前后肢差異表達基因?qū)哟尉垲惙治鰺釄DFigure 2 Heat map of hierarchical analysis of the differentially expressed genes between the fore and hind limbs

2.4 qPCR驗證

我們從基因相互作用分子網(wǎng)絡(luò)圖中，隨機挑選了Hoxc10、Hoxc9、Pitx1基因進行qPCR檢測，以及在cluster3中前肢特異表達的Tbx5基因作為陰性對照。qPCR結(jié)果如圖4所示，在小鼠胚胎期E10.5 d，后肢特異的Hoxc10、Hoxc9、Pitx1基因的表達量相較于前肢分別提高了397.4倍、5.5倍及59.2倍，陰性對照前肢特異的Tbx5基因，后肢表達量僅僅為前肢的0.03倍，結(jié)果表明qPCR結(jié)果真實可靠。再與芯片結(jié)果比較，后肢相較于前肢Hoxc10、Hoxc9、Pitx1及Tbx5基因的Fold Change值分別為42.5(上調(diào))、4.9(上調(diào))、33.7(上調(diào))及-16.7(下降)，qPCR結(jié)果與芯片結(jié)果一致，說明芯片結(jié)果可靠。

3 討論

小鼠在胚胎發(fā)育過程中，在胚胎期E10.5 d開始出現(xiàn)后肢的胚芽形態(tài)，多種基因及信號因子的開始表達，調(diào)控后續(xù)肢體的位置及形態(tài)[16-17]。利用這一特征，我們通過小鼠胚胎期E10.5 d前后肢表達譜芯片篩選出275個差異表達的基因，而這些基因在基因的轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)控、多器官的發(fā)育、骨骼系統(tǒng)的發(fā)育、細胞粘連和細胞分化等方面發(fā)揮著重要的功能。其中，大部分生物學(xué)功能集中于基因的轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)控中，包括基于DNA的轉(zhuǎn)錄過程和基于DNA的翻譯過程等，表明之所以后肢相對于前肢位置及形態(tài)上會有差別，是因為后肢發(fā)育還受到多種基因轉(zhuǎn)錄過程中轉(zhuǎn)錄因子及基因翻譯過程中信號因子的表達調(diào)控。

將差異表達的基因進行了層次聚類分析，其中后肢特異表達的cluster 4中的基因，通過MGI人類/小鼠疾病模型數(shù)據(jù)庫的搜索，我們發(fā)現(xiàn)Aldh1a2、Hoxc9、Gata6、Pitx1等14個基因都與肢體、骨骼發(fā)育缺陷的疾病模型相關(guān)(數(shù)據(jù)未顯示)。Niederreither等[18]研究發(fā)現(xiàn)Aldh1a2基因的突變會導(dǎo)致小鼠后肢的完全缺失。Kozhemyakina等[19]研究發(fā)現(xiàn)條件敲除Gata6基因的小鼠后肢的前端會發(fā)生Shh信號及下游基因紊亂表達，并在后肢前端出現(xiàn)多趾頭的性狀。Marcil等[20]研究發(fā)現(xiàn)Pitx1和Pitx2基因的純合突變會導(dǎo)致小鼠后肢股骨縮短、腓骨及脛骨形態(tài)的異常、以及腳趾缺失。

圖3 后肢特異表達的基因相互作用分子網(wǎng)絡(luò)圖Figure 3 Network diagram of the gene interaction molecules specifically expressed in the hind limbs

為了更好的認識后肢區(qū)別于前肢分子水平的表達變化及重要的核心基因，我們對后肢特異表達的基因進行了分子網(wǎng)絡(luò)圖的繪制。從圖3中，我們可以看出這些基因在分子網(wǎng)絡(luò)上的相互作用關(guān)系，機制復(fù)雜，大部分基因涉及基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。其中，我們挑選了在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控上具有代表性的Hoxc10、Hoxc9、Pitx1這3個基因，在表達水平上進行qPCR驗證，其結(jié)果與芯片結(jié)果一致，表明芯片結(jié)果可靠。并通過已有研究顯示Tbx4和Pitx1基因都是已知的特異調(diào)控后肢形態(tài)的轉(zhuǎn)錄因子[11,15]。因此，分子網(wǎng)絡(luò)中的這些基因?qū)椴溉閯游锖笾螒B(tài)形成的發(fā)育調(diào)控研究提供重要的依據(jù)。

綜上所述，本研究通過小鼠前后肢基因表達譜芯片差異基因的聚類分析及信號通路分析，獲得后肢特異表達核心基因，并通過qPCR驗證部分基因，為哺乳動物肢體發(fā)育研究提供基礎(chǔ)。

注：后肢特異的Hoxc10、Hoxc9、Pitx1基因的表達量相較于前肢分別提高了397.4倍、5.5倍及59.2倍，而前肢特異的Tbx5基因，后肢表達量僅為前肢的0.03倍。P< 0.001。圖4 qPCR檢測前后肢Hoxc10、Hoxc9、Pitx1及Tbx5基因相對表達水平Note. The expression levels of hindlimb-specific Hoxc10, Hoxc9, and Pitx1 genes were 397.4-fold, 5.5-fold, and 59.2-fold higher than those in the forelimbs, respectively, while the forelimb-specific Tbx5 gene was only 0.03 times in the hind limbs than in the fore limbs. P< 0.001.Figure 4 Relative expression levels of Hoxc10, Hoxc9, Pitx1 andTbx5 genes between the fore and hind limbs with qPCR detection

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