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(1.大連海洋大學 遼寧省海洋生物資源恢復與生境修復重點實驗室，遼寧 大連 116023；2.大連海洋大學 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023)

1962年，Wolf等[1]第一次成功建立了虹鱒Oncorhynchusmykiss生殖腺細胞系RTG-2后，越來越多的魚類細胞系被建立。其中利用鰭組織建立的細胞系約為36種，如西伯利亞鱘AcipenserbaeriBrandt[2]、泥鰍Misgurnusanguilicaudatus[3]、稀有鮈鯽Gobiocyprisrarus[4]、斜帶石斑魚Epinepheluscoioides[5]等。細胞系作為一個研究平臺在免疫學、病毒學、環(huán)境毒理學等方面有著成本低、試驗條件可精確控制、試驗效果直觀等多種優(yōu)點[6]。

紅鰭東方鲀Takifugurubripes隸屬于鲀形目tetraodontiformers、鲀亞科Tetraodontoidei、鲀科Tetxaodontidae、東方鲀屬Takifugu，是重要的經(jīng)濟魚類之一[7]。近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，疾病時有發(fā)生，尤其是病毒病，已經(jīng)給所屬產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。迄今報道的魚類病毒已經(jīng)超過70余種，分別屬于18個不同的科[8]。與紅鰭東方鲀相關(guān)的病毒有淋巴囊腫病毒(Lymphocystis disease virus, LCDV)、傳染性造血器官壞死病毒(Infectious haematopoietic necrosis virus)、神經(jīng)壞死病毒(Nervous necrosis virus,NNV)、雙鏈DNA棒狀病毒(ds DNA baculovirus)、野田病毒(Nodamura virus)、敗血癥病毒(Viral hemorrhagic septice-mia virus)和白口病病毒(即紅鰭東方鲀吻唇潰爛病毒，Takifugu rubripes snout ulcer virus，TSUV)等。病毒病的研究必須依賴于對該病毒具有易感性的細胞。目前，已建立的紅鰭東方鲀細胞系只有精巢細胞系，尚未見到其他組織細胞系建立的報道。細胞系的匱乏，極大地限制了紅鰭東方鲀病毒病的診斷與治療，為此，急需其他組織細胞系的建立來填補這一空白。本試驗中，建立了紅鰭東方鲀鰭細胞系，旨在為研究該魚病毒的感染機理、感染途徑、病毒的體外培養(yǎng)和疫苗的研發(fā)制備提供基礎條件。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用紅鰭東方鲀采自大連市天正養(yǎng)魚場，3齡，體長為11 cm。紅鰭東方鲀運回實驗室后在水槽(90 L)中暫養(yǎng)。

試驗試劑：0.25%胰蛋白酶溶液、1000 IU/mL和500 IU/mL的青霉素-鏈霉素雙抗溶液均購于Hyclone公司；硫酸軟骨素購于Wolsen公司；人堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和I 型胰島素樣生長因子(IGF-I)購于Peprotech公司；其他化學試劑均為分析純。試驗所用的PCR擴增引物購于生工生物工程(上海)股份有限公司，基因組DNA提取試劑盒購于大連賽拓生物公司。

1.2 方法

1.2.1 原代培養(yǎng) 參考李霞等[3]的原代啟動試驗方法。將紅鰭東方鲀放入含0.2% 1000 IU/mL青鏈霉素混合液的新鮮海水中暫養(yǎng)3 h，然后用0.1%的苯甲醇和濃度為0.2%的1000 IU/mL青鏈霉素混合液進行麻醉處理，并用75%的乙醇擦拭尾鰭和臀鰭組織。剪取尾鰭和臀鰭鰭末端組織，放入500 IU/mL的青霉素-鏈霉素雙抗溶液中消毒處理60 min, 中間換液1次。用pH值為7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗兩次，再用5%胎牛血清培養(yǎng)液漂洗1次，然后加入0.25%的透明質(zhì)酸酶液和0.1%的Ⅱ型膠原蛋白酶溶液處理30 min；將鰭組織塊剪成1 mm3左右的小塊，均勻涂布到細胞培養(yǎng)瓶中，每瓶20～30個。倒置24 h之后，翻轉(zhuǎn)并補加培養(yǎng)基至5 mL/瓶。所用培養(yǎng)液為添加bFGF(40 μL/mL)、硫酸軟骨素(10 μg/mL)和 IGF-I(10 μL/mL)的20% FBS-DMEM/F-12 高糖培養(yǎng)基。5～6 d后組織塊中有細胞遷出，當遷出細胞鋪滿單層培養(yǎng)瓶底時開始進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 傳代培養(yǎng) 加入PBS漂洗細胞1次；吸去PBS加入1 mL的胰蛋白酶溶液，約1 min之后，吸掉胰蛋白酶。加入原培養(yǎng)基，吹打。待細胞脫離培養(yǎng)瓶底部后吸出一半懸液至新培養(yǎng)瓶中，補加新培養(yǎng)基至5 mL/瓶，置于同樣的25 ℃、5% CO2濃度細胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所用培養(yǎng)液為20% 胎牛血清DMEM/F12 培養(yǎng)基，添加有硫酸軟骨素(10 μg/mL)、bFGF(10 ng/mL)等生長因子。 30代以后所用培養(yǎng)液為添加20% 胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基。

1.2.3 細胞凍存與復蘇 參考李霞等[3]的方法。細胞凍存液為20% FBS、60% DMEM/F-12培養(yǎng)基和20%二甲基亞砜混合溶液，存于 4 ℃冰箱中。取 35代細胞，以1000 r/min 離心 5 min, 棄上清液, 向沉淀中加入 1 mL 細胞凍存液，輕輕吹打制成細胞懸液, 調(diào)整細胞濃度至 1.0×106cells/mL, 再轉(zhuǎn)至凍存管中。先在4 ℃下存放30 min、-20 ℃下存放2 h，然后于-80 ℃下長期保存，或24 h后放入液氮(-196 ℃)中長期保存。

60 d后，將液氮中的細胞凍存管取出，迅速放入37 ℃水中，水浴解凍，當細胞凍存液融化約2/3后轉(zhuǎn)入超凈工作臺。吸取全部細胞凍存液置于離心管中，加入等量的 20% FBS-DMEM/F12培養(yǎng)基，以1000 r/min離心5 min，棄上清液，加入20% FBS-DMEM/F12培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打使細胞充分懸浮。將細胞懸液轉(zhuǎn)入新細胞培養(yǎng)瓶，補加培養(yǎng)基至5 mL/瓶。同時取100 μL細胞懸液于細胞培養(yǎng)瓶中，再加入等量臺盼藍染液，在顯微鏡下使用血球計數(shù)板，觀察活細胞數(shù)量并計數(shù)，通過公式計算細胞存活率，即

細胞存活率=活細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.2.4 生長曲線的測定 取生長狀況良好的37代紅鰭東方鲀鰭細胞，用胰蛋白酶進行消化后制成細胞懸液。以6.4×104cells/mL的細胞密度接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，體積為1 mL，共21個孔。將培養(yǎng)板置于25 ℃、 5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)7 d。每隔24 h取3孔細胞，在顯微鏡下觀察活細胞，并用血球計數(shù)板計數(shù)，取其平均值，以培養(yǎng)時間(d)為橫坐標，細胞數(shù)量(104cells/mL)為縱坐標繪制生長曲線。參考戴國俊等[9]的方法，采用SPSS 19.0軟件，將數(shù)據(jù)代入Logistic曲線模型表達式Nt=A/[1+B×exp(-K×t)]中進行擬合，生成生長曲線公式與相應方差。

1.2.5 細胞大小測定 選用紅鰭東方鲀35代生長狀況良好的鰭細胞，用0.25%的胰酶溶液消化1 min左右，形成細胞懸液，取100 μL細胞懸液至青霉素小瓶中。加入等量臺盼藍染液，在校正好的目鏡測微尺的倒置顯微鏡下，測量100個圓形活細胞的直徑，并對數(shù)據(jù)進行分析處理。

1.2.6 細胞親緣關(guān)系分析 選用紅鰭東方鲀37代生長狀況良好的細胞作為試驗組，以紅鰭東方鲀成體魚鰭組織與鯽Carassiusauratus鰭組織作為對照組。在超凈工作臺內(nèi)將紅鰭東方鲀與鯽解剖，分別提取出其鰭組織放入離心管中，加入胰蛋白酶將組織消化為細胞懸液。之后按照TIANGEN公司的提取DNA試劑盒步驟對紅鰭東方鲀鰭細胞系細胞、紅鰭東方鲀成體魚鰭組織、鯽鰭組織進行處理，提取出各自完整的DNA。

PCR引物的制備：參考郝君等[10]的方法，設計4對引物，其退火溫度均為56 ℃(表1)。

微衛(wèi)星位點的PCR擴增：建立了體積為25 μL的反應體系，內(nèi)含約50 ng基因組DNA，1 ng/μL引物，1 U Taq DNA聚合酶，18 μL PCR緩沖液。在PE9700型擴增儀上進行PCR反應。反應程序為：94 ℃下變性30 s，56 ℃下退火30 s，72 ℃下反應30 s，共進行40個循環(huán)；再于72 ℃下延伸7 min。

最后將擴增產(chǎn)物經(jīng)含有1% goodview的10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外投射儀下觀察結(jié)果并拍照。

表1 微衛(wèi)星引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 原代培養(yǎng)

將紅鰭東方鲀鰭組織培養(yǎng)3～4 d后，大量的細胞從組織塊中遷出，可以觀察到明顯的生長暈(圖1-A)。遷出的細胞成纖維樣，多突起且貼壁生長，生長分裂旺盛(圖1-B)。 6～7 d 后，組織塊周圍形成單層, 培養(yǎng)30 d左右鋪滿培養(yǎng)瓶底部。

2.2 傳代培養(yǎng)及細胞系的建立

紅鰭東方鲀鰭細胞系細胞在傳代后6～7 d可鋪滿培養(yǎng)瓶底部。細胞透明、均質(zhì)，生長狀況良好，成纖維細胞樣。30 代以后停止添加I 型胰島素樣生長因子(IGF-I)、人堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和硫酸軟骨素等生長因子, 細胞生長及分裂狀況仍然良好(圖2)。目前, 紅鰭東方鲀鰭細胞系已傳代至40代，成功建立了紅鰭東方鲀鰭組織細胞系。

2.3 細胞凍存與復蘇

在液氮中貯藏60 d的紅鰭東方鲀鰭細胞凍存復蘇后，大部分細胞呈梭形或纖維型，貼壁較好，6～7 d可以長滿培養(yǎng)瓶底部。細胞凍存復蘇的存活率為84.20%±2.20%。置于超低溫冰箱(-80 ℃)中的紅鰭東方鲀細胞凍存復蘇后，情況相似，細胞形態(tài)未有明顯變化，存活率約為83.22%±4.18%。

注：A為細胞生長暈；B為遷出細胞成纖維樣Note:A,growth halo is appeared;B,cells are fibroblastoid圖1 原代培養(yǎng)第5天時的紅鰭東方鲀鰭細胞Fig.1 Fin cells of redfin puffer Takifugu rubripes in primary culture at the fifth day

圖2 紅鰭東方鲀37代鰭組織細胞Fig.2 Fin cells in the 37 generations of redfin puffer Takifugu rubripes

2.4 細胞生長曲線

從第37代紅鰭東方鲀鰭細胞的生長曲線(圖3)可知，培養(yǎng)于25 ℃、CO2濃度為5%、20%FBS-DMEM/F12高糖培養(yǎng)基中的紅鰭東方鲀鰭細胞在0～2 d內(nèi)處于潛伏期，2～4 d時進入對指數(shù)生長期，細胞處于生長高峰，4～5 d時進入穩(wěn)定期，5 d后轉(zhuǎn)入衰退期，細胞數(shù)量開始減少。群體倍增時間約為50.24 h。

由SPSS 19.0軟件輸出結(jié)果可見，曲線擬合的相關(guān)指數(shù) (即擬合度，R2)為

生長曲線為

圖3 紅鰭東方鲀鰭細胞37代生長曲線Fig.3 Growth curve of fin cells in the 37 generations of redfin puffer Takifugu rubripes

2.5 細胞來源鑒定

本試驗中擴增了4對引物，但是所選用的第1對微衛(wèi)星引物能擴增出效果較好的PCR產(chǎn)物。其他兩條未有明顯條帶。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖4)顯示，本研究中所建立的紅鰭東方鲀鰭細胞系與紅鰭東方鲀鰭組織電泳結(jié)果清晰，在500～750 bp位置有相同條帶，而鯽鰭組織在此位置并無條帶產(chǎn)生，說明紅鰭東方鲀鰭細胞與紅鰭東方鲀鰭組織為同一物種，具有相同的微衛(wèi)星位點。

3 討論

3.1 紅鰭東方鲀細胞系建立方法

用于海水魚類細胞培養(yǎng)使用的人工合成培養(yǎng)基主要有MEM、 L-15、DMEM/F12、DMEM、Medium 199等。建立線鱧Channastriatus肌肉細胞系[11]、遮目魚Chanoschanos胚胎細胞系[5]、斜帶石斑魚Epinepheluscoioides眼細胞系[5]、紅點石斑魚Epinephelusakaara脾臟細胞系[12]時，均使用了L-15培養(yǎng)基。而半滑舌鰨Cynoglossussemilaevis心臟細胞系[13]的建立采用的培養(yǎng)基則為MEM。本試驗中利用的是DMEM/F-12高糖培養(yǎng)基，與Chen等[14]建立的大菱鲆Scophthalmusmaximus胚胎細胞系，Holen等[15]建立的大西洋鱈Gadusmorhua胚胎細胞系，Sha等[16]建立的半滑舌鰨胚胎細胞系所用培養(yǎng)基相同。說明不同的魚類細胞系對培養(yǎng)基的要求有所不同。

注：M為DL2000 Marker;1為紅鰭東方鲀細胞樣品；2為紅鰭東方鲀鰭組織樣品；3為鯽鰭組織樣品Note:M,DL2000 Marker;1,redfin puffer fin cell sample; 2,redfin puffer fin tissue sample; 3,crucian carp fin tissue sample圖4 紅鰭東方鲀鰭細胞與鰭組織及鯽鰭組織PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of amplified PCR of fin cells, and fin tissue in redfin puffer Takifugu rubripes and fin tissue of crucian carp Carassius auratus

為了促進細胞的增殖和貼壁生長，在原代培養(yǎng)和早期傳代培養(yǎng)的培養(yǎng)基中會添加促生長因子、成纖維細胞生長因子(Fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)和胰島素樣生長因子(IGF)等十分常用。成纖維生長因子通過影響RNA聚合酶，加強核蛋白體基因的轉(zhuǎn)錄，從而加速細胞周期，促進細胞的分裂與增殖[17-18]。高首鱘鰭Acipensertransmontanus細胞系[19]和大菱鲆鰭細胞系[20]在原代培養(yǎng)和早期傳代培養(yǎng)時均添加了bFGF因子。毛凝等[21]在探究歐洲鰻鱺Anguillaanguilla胸鰭細胞的最適培養(yǎng)條件時，也證明bFGF對該細胞的增殖與分裂有促進作用。IGFs是一類小分子的單鏈多肽物質(zhì)，是胰島素樣生長因子家族中的一員。通過與細胞膜上的受體IGFR結(jié)合并經(jīng)Ras-Raf通路來促進細胞增殖。由于bFGF作用于G2M期的細胞，IGF作用于S期、G0期和G1期的細胞，他們作用的時間不同，所以聯(lián)合使用應可以達到更好的促增殖效果[18]。本試驗中參考前人的工作，在原代和早期培養(yǎng)階段，添加了上述兩種因子，收到很好的效果，進一步證實成纖維細胞因子和胰島素樣生長因子在細胞培養(yǎng)中具有促進細胞分裂和生長的作用。

3.2 培養(yǎng)細胞的生長

生長曲線可用來測定細胞的絕對生長數(shù)值，直觀的表現(xiàn)細胞生長過程中的數(shù)量變化，也是細胞試驗中基本的試驗參數(shù)之一。通過潛伏期、對數(shù)生長期、平臺期等階段的時間長短總結(jié)細胞的生長分裂規(guī)律，預測細胞的生長趨勢。魚類鰭細胞潛伏期多為1～2 d，指數(shù)生長期為2 d左右，平臺期為1 d左右，之后細胞數(shù)量減少，進入衰退期。如肖藝等[22]報道的錦鯉Cyprinuscarpio鰭細胞系的生長曲線顯示，0～1.5 d為潛伏期, 1.5～3.5 d處于對數(shù)期, 3.5～4.5 d為平臺期, 4.5 d后進入衰退期,錦鯉鰭細胞的群體倍增時間為43.5 h。樊廷俊等[20]報道的大黃魚Larimichthyscrocea鰭細胞系的生長曲線顯示，接種后1 d為潛伏期，1～3 d為對數(shù)期，3～4 d為平臺期。群體倍增時間為50.96 h。樊廷俊等[23]報道的褐點石斑魚Epinephelusfuscoguttatus鰭細胞系的生長曲線顯示，生長周期為5～6 d時，群體倍增時間為50.6 h。本試驗中紅鰭東方鲀鰭細胞的生長曲線顯示，0～2 d內(nèi)處于潛伏期，2～4 d時進入對數(shù)期。4～5 d時進入平臺期，5 d后開始轉(zhuǎn)入衰退期。紅鰭東方鲀鰭細胞系的倍增時間為50.24 h，與已有的報道相似。說明在相近的培養(yǎng)條件下魚類鰭細胞的生長基本一致。

3.3 細胞來源分析方法

微衛(wèi)星DNA序列是DNA分子中一段高度重復序列，由2～6 bp的重復單位構(gòu)成的DNA序列，一般有100～300 bp不等。微衛(wèi)星DNA數(shù)量多且均勻分布在基因組中，具有高度的多態(tài)性、結(jié)果穩(wěn)定性高等優(yōu)點，是一種理想的遺傳標記，已普遍應用于水生生物遺傳多樣性的分析、種質(zhì)鑒定、親緣關(guān)系鑒定、遺傳圖譜建立當中。劉海金等[24]利用微衛(wèi)星分析了牙鲆Paralichthysolivaceus的遺傳關(guān)系；趙程等[25]利用微衛(wèi)星技術(shù)鑒定了5種不同鱖魚屬的親緣關(guān)系遠近，探究了鱖魚的遺傳潛能和遺傳改良的可能性；任昆等[26]利用微衛(wèi)星進行了草魚Ctenopharyngodonidellus親子關(guān)系的鑒定。以往對培養(yǎng)細胞來源的鑒定大多利用染色體制備和數(shù)量、核型分析方法，但是端粒會隨著細胞有絲分裂次數(shù)的不斷增加而不斷地縮短，端粒的丟失會使傳代細胞染色體變異的可能性增高。另外，制片過程中染色體的丟失，對試驗結(jié)果準確性也會產(chǎn)生影響。

本試驗中采用微衛(wèi)星位點檢測，確定紅鰭東方鲀鰭細胞和紅鰭東方鲀鰭組織之間的親緣關(guān)系，試驗結(jié)果誤差更小，準確高效，觀察直觀，操作簡單，實用性更好。