趙蔚波，王 琦，鄭燕飛，姚海強，王 濟

（北京中醫(yī)藥大學，北京100029）

體質是在先天遺傳和后天獲得的基礎上，表現(xiàn)出的形態(tài)結構、生理機能以及心理狀態(tài)等方面綜合的、相對穩(wěn)定的特質，這種特質決定著人體對某種致病因子的易感性及其病變類型的傾向性。國醫(yī)大師王琦教授根據中國人的體質特點，以中醫(yī)理論為基礎，將人的體質分為平和質、氣虛質、陽虛質、陰虛質、痰濕質、濕熱質、血瘀質、氣郁質、特稟質（過敏質）[1]。隨著現(xiàn)代分子生物學的發(fā)展，不斷有新的方法和技術涌現(xiàn)。包括基因組學、蛋白質組學、代謝組學的系統(tǒng)生物學研究技術已被逐漸應用于中醫(yī)體質的研究領域，并已取得了一定的研究成果[2-3]。如何利用單細胞測序技術對中醫(yī)體質展開研究，筆者試作探討。

1 單細胞測序技術及其在醫(yī)藥領域的應用

1.1 單細胞測序技術概況 單細胞測序技術是指對單細胞基因組或轉錄體進行測序，以獲得基因組、轉錄組或其他多組學信息，以揭示細胞群體差異和細胞進化關系。傳統(tǒng)的測序方法只能得到多個細胞的平均值，不能分析少數(shù)細胞，丟失細胞異質性信息。與傳統(tǒng)的測序技術相比，單細胞技術具有檢測單個細胞間異質性的優(yōu)點[4]。人體由不同類型和起源的萬億個細胞組成，每個細胞在人體系統(tǒng)中都發(fā)揮著各自的作用。這些細胞可以被視為支持不同身體狀態(tài)的基本但必不可少的生物單位，例如健康、疾病或對治療的反應[5]。每個細胞都是獨一無二的，即使是相同細胞系或個體來源的細胞，彼此的基因組、轉錄組和表觀基因組都會有所差異[6]。單細胞測序技術旨在單個細胞水平對基因組或轉錄組進行擴增并測序，檢測單核苷酸變異（NVs）、基因拷貝數(shù)變異（NVs）、單細胞基因組結構變異、基因表達水平、基因融合、單細胞轉錄組的選擇性剪接、單細胞表觀基因組的DNA甲基化狀態(tài)等[7]。

1.2 單細胞測序技術在醫(yī)藥領域的應用 單細胞測序技術已在癌癥、微生物學、神經學、生殖、免疫學、消化系統(tǒng)中得到應用，并取得成果。其中在癌癥領域具有重要地位，已有研究繪制了肝癌微環(huán)境免疫圖譜和肺癌T細胞免疫圖譜，揭示了肝癌和肺癌免疫細胞的亞組分類、組織分布特征、腫瘤異質性和藥物靶基因表達情況，有助于了解肝癌和肺癌的免疫微環(huán)境，尋找有效的生物標志物、新的腫瘤免疫治療方法和藥物靶點[8-9]。使用單細胞mRNA測序（scRNAseq）在最早階段了解乳腺癌的起源，并可能最終形成預防癌癥進展的基礎[10]。

單細胞測序在血液病的研究，有助于發(fā)現(xiàn)高異質性血液病的分類標志，分析其發(fā)病原因，為臨床診斷和治療疾病提供理論依據。進一步確定了與原發(fā)性血小板增多癥（ET）相關的候選突變，并推測這些突變可能與腫瘤進展有關[11]。通過靶向單細胞測序證明T細胞急性淋巴細胞白血?。═-All）的突變序列，T-ALL的發(fā)育可以在多能祖細胞中開始[12]。在神經學研究中，應用單細胞測序技術鑒定了人類中期胚胎多個區(qū)域細胞的多個亞群體，并分析了這些區(qū)域的基因表達和神經元成熟[13]。通過單細胞測序繪制的小鼠小腦發(fā)育圖中，確定了一個小腦細胞子集和一個有利于小腦發(fā)育的亞群體，將有助于今后對小腦發(fā)育、神經生物學和疾病的研究[14]。

在生殖醫(yī)學應用中，單細胞測序技術可以檢測出少數(shù)細胞的優(yōu)勢，可用于產前診斷和輔助生殖[15-16]。應用單細胞測序技術對妊娠早期胎盤細胞進行轉錄組分析，有助于胎盤和生殖成功[17]。在免疫學領域，用單細胞RNA測序法研究持續(xù)感染期間的免疫細胞和細胞因子。研究發(fā)現(xiàn)不同感染時IL-10表達CD4 T細胞的異質性和輔助性細胞產生IL-10在促進體液免疫中起著重要作用[18]。在消化系統(tǒng)的應用中，發(fā)現(xiàn)許多新的腸上皮細胞亞型，并解釋了腸道細胞維持穩(wěn)態(tài)和對病原微生物反應的機制[19]。應用高精度單細胞轉錄組序列分析人胚胎期的四個消化器官和成人大腸的多個細胞，揭示基因調控在人類四個消化器官發(fā)育過程中的相關機制[20]。但未能查閱到單細胞測序技術與中醫(yī)結合進行的研究。

2 單細胞測序技術在中醫(yī)體質學研究中應用的思考

國醫(yī)大師王琦教授對中醫(yī)體質學進行系統(tǒng)闡述，首先提出中醫(yī)體質學的四個基本原理，概括為稟賦遺傳論、形神構成論、生命過程論、環(huán)境制約論，構筑了中醫(yī)體質理論體系的基石。后又相繼指出：體質可分論、體質可調論、體病相關論，作為體質研究的三個關鍵科學問題，成為進行體質研究的總體框架[21]。單細胞測序可應用在對中醫(yī)體質的“基本原理”或“關鍵問題”等方面的闡釋，對此試作以下探討。

2.1 應用于中醫(yī)體質學“稟賦遺傳論” 中醫(yī)體質學“稟賦遺傳論”認為稟賦遺傳是決定體質形成和發(fā)展的主要內在因素。體質差異、個體體質的形成在很大程度上是由遺傳所決定的，不同個體的體質特征分別具有各自不同的遺傳背景，這種由遺傳背景所決定的體質差異，是維持個體體質特征相對穩(wěn)定性的一個重要因素。從基因水平及其表達產物水平揭示體質差異的遺傳學機制，已成為中醫(yī)體質學的研究方向之一。由于體質是一個整體的性狀，故難以用一個基因或一個蛋白質來詮釋其差異性，現(xiàn)在多采用組學的方法進行研究。已有研究用單細胞測序法檢測卵細胞極性細胞或胚胎細胞，選擇健康胚胎移植，可以降低先天性遺傳病新生兒的出生率，有助于預防遺傳病[15-16]。

2.2 應用于中醫(yī)體質學“生命過程論” 中醫(yī)體質學“生命過程論”認為體質是一種按時相展開的，與機體發(fā)育同步的生命過程。體質的發(fā)展過程表現(xiàn)為若干階段，幼年稚陰稚陽→青年氣血漸盛→壯年氣血充盛→老年五臟氣衰。其中每個階段的體質特性也有相應的差異，這些不同的體質階段依機體發(fā)育的程序相互連接，共同構成個體體質發(fā)展的全過程。不同個體的體質發(fā)展過程，由于先天稟賦的不同而表現(xiàn)出個體間的差異性。用單細胞測序研究小鼠個體小膠質細胞在發(fā)育期間、老年時和腦損傷后的RNA表達模式，在年輕小鼠中發(fā)現(xiàn)了最大的小膠質細胞異質性；然而，一些狀態(tài)-包括富含趨化因子的炎性小膠質細胞-在整個生命周期中持續(xù)存在或在老年小鼠腦中持續(xù)存在[22]。對不同狀態(tài)的小鼠CD4+T細胞進行單細胞RNA測序，發(fā)現(xiàn)衰老影響細胞轉錄動力學，有助于解釋隨著年齡的增長免疫系統(tǒng)的削弱[23]。

2.3 應用于中醫(yī)體質學“形神構成論” 中醫(yī)體質學“形神構成論”認為體質是特定軀體素質與相關心理素質的綜合體，構成體質的軀體素質和心理素質之間的聯(lián)系是穩(wěn)定性與變異性的統(tǒng)一，體質分型或人群個體差異性的研究應當注意到軀體-心理的相關性。用單細胞測序研究神經元細胞，研究長散在核元件與神經元的關系。發(fā)現(xiàn)在神經元干細胞向干細胞分化的過程中，長散在核元件會通過反轉錄轉座在基因組內發(fā)生跳躍形成新的插入，而且每個神經元可能含有獨特的長散在核元件插入，每個神經元可能不同于其他的神經元，這些差異可能影響個體對神經疾病的易感性[24]。

2.4 應用于“體質可分”研究 中醫(yī)體質學“體質可分論”認為，體質的形成與先后天多種因素相關。在生命的不同階段個體的體質特征進行著動態(tài)的變化，所以體質表現(xiàn)出個體差異性，呈現(xiàn)動態(tài)多樣性[25]。中醫(yī)體質學認為體質的形成是遺傳和環(huán)境共同作用的結果，通過單細胞測序技分析不同細胞類型中微量的個體細胞表達情況，可以鑒別出許多差異表達基因，發(fā)現(xiàn)不同的表達模式和特異性標記[4]。運用單細胞測序技術對不同體質類型的人群外周血中單個核細胞進行檢測和分析，可以對體質差異中所伴隨差異表達基因進行了解和認識，就有可能發(fā)現(xiàn)相關體質類型的基因標志物簇，從而找到體質可分的生物學依據，進而為單細胞測序方法進行中醫(yī)體質關鍵科學問題的研究奠定基礎。

2.5 應用于“體病相關”研究 中醫(yī)體質學“體病相關論”認為，由于受先天因素或后天因素的影響，個體體質的差異性對某些致病因素有著易感性，或對某些疾病有著易罹性、傾向性，形成某類疾病發(fā)生的背景或基礎[25]。以單細胞測序技術檢測受試者外周血細胞群特征，發(fā)現(xiàn)每種體質類型特點，比較不同體質類型差異。已有研究通過單細胞轉錄體序列分析證實了候選致病基因在先天性腎病中的表達特點，為治療先天性腎病作出了一定的貢獻[26]。因此對人體體質進行的單細胞測序技術檢測應用于人體疾病的預測具有可行性，可望實現(xiàn)重大疾病早期預測、早期預警，為疾病防治提供研究基礎和臨床依據。

2.6 應用于“體質可調”研究 中醫(yī)體質學“體質可調論”認為體質既稟成于先天，亦關系于后天。體質的穩(wěn)定性由相似的遺傳背景形成，年齡、性別等因素也可使體質表現(xiàn)出一定的穩(wěn)定性。然而，體質的穩(wěn)定性是相對的，每一個體在生長壯老的生命過程中，因受環(huán)境、精神、營養(yǎng)、鍛煉、疾病等內外環(huán)境中諸多因素的影響，而使體質發(fā)生變化，從而使得體質具有相對的穩(wěn)定性同時具有動態(tài)可變性，這種特征是體質可調的理論基礎[25]。多發(fā)性骨髓瘤（MM）是一種骨髓（BM）衍生的漿細胞癌，從多發(fā)性骨髓瘤病人中分離出腫瘤細胞進行單細胞分析，利用單細胞測序（DNA測序）技術監(jiān)測基因突變和對該病的治療效果，且該研究表明MM CTC分析可能取代骨髓（BM）活檢[27]。因此利用單細胞測序技術預測和監(jiān)控治療效果和預后情況可行。

3 展望

中醫(yī)體質學強調人體體質的整體性和系統(tǒng)性。中醫(yī)體質研究應以中醫(yī)理論為指導，將宏觀與微觀研究相結合，單靠一個技術或學科的運用難以獲得有效突破。借用單細胞測序技術和現(xiàn)代實驗方法，更加深入地探求人體體質形成的機理和規(guī)律，探索人體體質與疾病關系的潛在生物學機制，為中醫(yī)體質學研究領域提供更加廣泛的客觀依據。隨著測序成本的降低，通過提供更準確的信息，單細胞擴增方法將在未來獲得更多的優(yōu)勢。單細胞測序技術的研究和檢測會更加細致深入，應用領域也會越來越廣，在單個細胞水平探討生命過程將以全新的視角探究生命活動規(guī)律，造福人類健康。