小茴香中反式茴香腦的含量測定及其變化規(guī)律研究*

汪作元，李 敏，楊 靜，柴 欣，王躍飛

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617）

小茴香為傘形科植物茴香（Foeniculum vulgare Mill．）的干燥成熟果實(shí)，又名懷香、懷香子、茴香子，具有溫腎暖肝、散寒止痛、理氣和胃之功效[1]。小茴香常被用作調(diào)味品和香料，小茴香主要含有揮發(fā)油、脂肪油、甾醇、糖苷、氨基酸等多種成分[2]，揮發(fā)油是小茴香的主要藥效成分[3]，現(xiàn)已從小茴香揮發(fā)油中分離出40種化合物，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抑菌、抗氧化等作用[4-5]。研究表明揮發(fā)油中主要成分為反式茴香腦，占揮發(fā)油含量的80%左右[6]，分布在葉、花、果實(shí)中，以果實(shí)中揮發(fā)油及反式茴香腦含量最高。反式茴香腦作為升白寧注射液的主要成分，對預(yù)防和治療白細(xì)胞減少癥具有良好的效果[7]。

小茴香中反式茴香腦易揮發(fā)，文獻(xiàn)報(bào)道多采用GC[8-10]、GC-MS聯(lián)用儀[11]等方法進(jìn)行測定。反式茴香腦具有共軛結(jié)構(gòu)，紫外吸收較好；液相色譜儀普及性高且操作便利性好。本研究建立了超高效液相色譜法（UPLC）測定小茴香中反式茴香腦含量的方法，并分析了小茴香及其鹽制品中反式茴香腦的含量差異；研究了室溫條件下小茴香藥材（生品）及其粉末中反式茴香腦隨放置不同時(shí)間的含量變化規(guī)律。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters ACQUITYTMUPLC超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；DL-180E超聲儀（50 kHz，180W）；XS205十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；AL204型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）；TGL-16C臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 材料 小茴香藥材（生品）（S1～S7），產(chǎn)地為內(nèi)蒙古；其中藥材S1～S4購自河北春開制藥股份有限公司；藥材S5～S7購自天津中藥飲片有限公司。鹽小茴香飲片（Y1～Y4）是作者參照鹽制法炮制工藝炮制；鹽小茴香飲片（Y5～Y7），產(chǎn)地為內(nèi)蒙古，購自天津中藥飲片有限公司；反式茴香腦（批號：18041304）購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；甲醇（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）；甲酸（色譜純，阿拉?。?；屈臣氏蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；無水乙醇（分析純，天津市康科德科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 小茴香藥材（生品）及粉末穩(wěn)定性研究 取小茴香藥材（生品）（S1）適量，等量分裝于9個(gè)密封袋中，分別于 1、2、3、4、5、10、20、31、44 d 取樣。

取小茴香藥材（生品）（S1）適量，粉碎，粉末（過三號篩）等量分裝于9個(gè)密封袋中，分別于1、2、3、4、5、10、20、31、44 d 取樣。

取小茴香藥材（生品）（S1）適量，粉碎，粉末（過三號篩）置于同一密封袋中，分別于 0、1、2、3、4、6、8、10、12 h 取樣。

2.2 鹽小茴香飲片的炮制 小茴香藥材（生品）200g，精密稱定，置于炒藥鍋內(nèi)，將小茴香翻炒均勻，炒至微顯火色，噴淋25%鹽水溶液（每100 kg小茴香用食鹽2 kg），繼續(xù)炒至微干，炒制15 min（功率1 300 W），取出，放涼。

2.3 對照品溶液的配制 取反式茴香腦對照品適量，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇配制成0．94mg/mL 的儲備液，取適量儲備液配制成 18．8μg/mL的對照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備 取小茴香，粉碎，取粉末（過三號篩）0．5 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加入適量無水乙醇，密塞，室溫下超聲處理（功率144 W，頻率40 kHz）10 min，放冷至室溫，定容至刻度，搖勻，4℃下14 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL，置10 mL量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，即得。

2.5 色譜條件 色譜柱：Acquity UPLC?BEH C18（2．1 mm×50 mm，1．7 μm）；流動相：甲醇-0．1%甲酸水（55：45），流速 0．3 mL/min；檢測波長 254 nm；進(jìn)樣量2μL；柱溫40℃；樣品箱溫度5℃。

2.6 方法學(xué)考察

現(xiàn)階段，VR仍然處于發(fā)展初期，為使VR新聞的內(nèi)容與形式發(fā)展轉(zhuǎn)變，提高VR與新聞間的融合度，需要利用VR技術(shù)的沉浸式模式對VR新聞進(jìn)行改造。在傳遞新聞內(nèi)容上的感官體驗(yàn)時(shí)需要對新聞的生產(chǎn)方式進(jìn)行更新，并從新聞的各環(huán)節(jié)著手，設(shè)立多樣化的VR技術(shù)，讓VR新聞快速發(fā)展。為使VR技術(shù)更好地運(yùn)用于VR新聞中，提高VR新聞的價(jià)值，需要深入認(rèn)識VR技術(shù)的功能，準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)信息間的轉(zhuǎn)換。

2.6.1 線性關(guān)系考察 取適量反式茴香腦儲備液配制成濃度為 2．35 ～ 150．40 μg/mL 的系列對照品溶液，按“2．5”項(xiàng)下色譜條件測定，平行進(jìn)樣 2 次，以對照品濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程，反式茴香腦線性回歸方程為Y?=61 069X-12 840，相關(guān)系數(shù)r=0．999 9，表明反式茴香腦在 2．35 ～ 150．40 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密稱取小茴香藥材（生品）粉末（現(xiàn)粉），按“2．4”項(xiàng)下方法每天制備 1份小茴香供試品溶液，按“2．5”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，連續(xù)測定3 d，記錄峰面積，計(jì)算其RSD值，日內(nèi)精密度 RSD值為 0．40%，日間精密度 RSD值為1．11%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取小茴香藥材（生品）粉末（現(xiàn)粉）6份，按“2．4”項(xiàng)下方法制備小茴香供試品溶液6份，按“2．5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算反式茴香腦平均含量為10．17 mg/g；RSD值為0．50%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.6.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密稱取小茴香藥材（生品）粉末（現(xiàn)粉），按“2．4”項(xiàng)下方法制備小茴香供試品溶液，按“2．5”項(xiàng)下色譜條件分別于 0．5、1、1．5、2、2．5、3、3．5、4、4．5、5 h 進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算反式茴香腦的穩(wěn)定性RSD值為0．33%，表明供試品溶液室溫放置5 h穩(wěn)定性良好。

2.6.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的小茴香藥材（生品）粉末（現(xiàn)粉）0．25 g，準(zhǔn)確加入與樣品中反式茴香腦質(zhì)量相當(dāng)?shù)膶φ掌啡芤?，按?．4”項(xiàng)下方法制備小茴香供試品溶液，平行6份，按“2．5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定2次，反式茴香腦的平均加樣回收率為 102%，RSD=2．23%（n=6）。結(jié)果見表 1，表明反式茴香腦加樣回收率良好，方法準(zhǔn)確可行。

表1 小茴香藥材（生品）中反式茴香腦的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Test results of sam ple recovery rate of transanethole in raw Fructus Foeniculi（n=6）

2.7 小茴香藥材（生品）、鹽小茴香飲片中反式茴香腦的含量測定 采用已建立的UPLC分析方法測定不同批次小茴香藥材（生品）、鹽小茴香飲片。精密稱取不同批次的小茴香粉末（現(xiàn)粉），按“2．4”項(xiàng)下方法制備小茴香供試品溶液2份，按“2．5”項(xiàng)下色譜條件每份供試品溶液進(jìn)樣測定2次，計(jì)算不同批次小茴香粉末中反式茴香腦的含量，小茴香中反式茴香腦UPLC色譜圖見圖1，結(jié)果見表2。7批小茴香藥材（生品）中反式茴香腦的含量為 9．19～15．05 mg/g，2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定小茴香藥材含反式茴香腦不得少于1．4%，小茴香藥材（生品）（S1、S5～S7）不符合中國藥典的規(guī)定，合格率低于50%；7批鹽小茴香飲片中反式茴香腦的含量為9．09～16．02 mg/g，2015 年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定鹽小茴香飲片含反式茴香腦不得少于1．3%，鹽小茴香飲片（Y1、Y5～Y7）不符合中國藥典的規(guī)定，合格率低于50%。通過分析4批樣品炮制前后反式茴香腦的含量變化，鹽制后小茴香中反式茴香腦略有變化。

圖1 小茴香中反式茴香腦的UPLC色譜圖（A、對照品溶液B、供試品溶液）Fig.1 UPLC chromatogram of trans-anethole in Fructus Foeniculi（A.standard solution B.samp le solution）

2.8 小茴香藥材（生品）及其粉末放置不同時(shí)間對反式茴香腦含量的影響 反式茴香腦具有較強(qiáng)揮發(fā)性，其含量隨小茴香放置時(shí)間延長不斷下降[12-13]，本研究系統(tǒng)考察了小茴香藥材（生品）及其粉末在室溫下放置不同時(shí)間反式茴香腦的含量變化規(guī)律。

分別于 0、1、2、3、4、6、8、10、12 h 取小茴香藥材（生品）粉末適量，采用UPLC分別測定0 h樣品中反式茴香腦含量 a0，n 小時(shí)（n=1、2、3、4、6、8、10、12）樣品中反式茴香腦含量an。通過含量測定結(jié)果分析表明：小茴香藥材（生品）粉碎后12 h內(nèi)反式茴香腦隨放置時(shí)間延長含量不斷下降，在12 h時(shí)，其含量下降了23．23%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2-A。分別于第1、2、3、4、5、10、20、31、44 天從不同密封袋取小茴香藥材（生品）粉末適量，現(xiàn)取現(xiàn)測，采用UPLC分別測定了1 d 樣品中反式茴香腦含量 A1，n 天（n=2、3、4、5、10、20、31、44）樣品中反式茴香腦含量An。通過含量測定結(jié)果分析表明：小茴香藥材（生品）粉碎后在室溫條件下放置44 d內(nèi)反式茴香腦隨放置時(shí)間延長含量不斷下降，在44 d時(shí)，其含量下降了72．48%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2-B。

分別于第 1、2、3、4、5、10、20、31、44 天取小茴香藥材（生品）適量，粉碎，現(xiàn)粉現(xiàn)用，采用UPLC分別測定1 d樣品中反式茴香腦含量A1，n天（n=2、3、4、5、10、20、31、44） 樣品中反式茴香腦含量 An。通過含量測定結(jié)果分析表明：小茴香藥材（生品）在室溫條件下放置44 d內(nèi)反式茴香腦的含量基本穩(wěn)定，其含量無明顯變化，RSD值為2．90%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖2 小茴香藥材（生品）粉碎后在室溫條件下放置12 h反式茴香腦的含量變化情況（A）、放置44 d反式茴香腦的含量變化情況（B）Fig.2 The variation of trans-anethole content in Fructus Foeniculi（raw）storaged at room tem perature for 12 h（A）and for 44 d（B）after pulverization

圖3 小茴香藥材（生品）室溫下放置44 d現(xiàn)粉現(xiàn)測反式茴香腦的含量變化情況Fig.3 Thevariation of trans-anethole content in raw Fructus Foeniculistoraged at room temperature for 44 days（immediate detection after pulverization）

表2 不同批次小茴香藥材（生品）、鹽小茴香飲片中反式茴香腦的含量Tab.2 Contentsof trans-anethole in different batchesof Fructus Foeniculi（raw）and salt product pieces

通過系統(tǒng)研究小茴香藥材（生品）及其粉末在室溫下放置不同時(shí)間反式茴香腦的含量變化規(guī)律，揭示了小茴香藥材（生品）粉末中反式茴香腦含量隨放置時(shí)間延長不斷下降，而小茴香藥材（生品）中反式茴香腦含量基本穩(wěn)定。因此，開展小茴香中反式茴香腦的含量測定時(shí)，小茴香必須現(xiàn)粉現(xiàn)測。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)利用UPLC建立了小茴香中反式茴香腦的含量測定方法，本方法樣品前處理簡便，分析速度快，紫外吸收好，無其他成分干擾。

本實(shí)驗(yàn)從提取溶劑（甲醇、乙醇）、溶劑比例（25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、無水乙醇）、提取溫度[（0±5）、（20±5）、（40±5）、（60±5）℃]、提取時(shí)間（5、10、15、20 min）、料液比（1∶25、1∶50、1∶100）系統(tǒng)考察影響小茴香中反式茴香腦提取效率的因素，發(fā)現(xiàn)提取溶劑為無水乙醇、料液比為 1∶50、（20±5）℃超聲10 min提取效率最高。

通過本實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)小茴香藥材（生品）粉碎后反式茴香腦含量隨放置時(shí)間延長不斷下降，小茴香藥材（生品）中反式茴香腦含量在規(guī)定放置時(shí)間內(nèi)基本穩(wěn)定。反式茴香腦為小茴香的指標(biāo)成分，建議在進(jìn)行小茴香中反式茴香腦含量測定時(shí)，小茴香必須現(xiàn)粉現(xiàn)測，即小茴香粉碎后，其粉末需在半小時(shí)內(nèi)進(jìn)行處理，保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。