曹滿園，張宇飛，王麗英，曹俊國，李文，韓玉萍，許保增※，王守富

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春 130112；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長春 130118）

犬科動(dòng)物多為季節(jié)性、單次發(fā)情動(dòng)物，但經(jīng)馴養(yǎng)的家犬，其季節(jié)性發(fā)情特點(diǎn)逐漸消失，全年均可出現(xiàn)發(fā)情，尤其春、秋季節(jié)的發(fā)情比例較高[1]。犬的乏情期長[2]，平均可達(dá)到6～9 個(gè)月，有些犬科動(dòng)物乏情期甚至能達(dá)11 個(gè)月之久[1]。與其他哺乳動(dòng)物相比，犬的生殖生理具有特異性，犬卵母細(xì)胞所處的卵泡液中含有高達(dá)1 000 倍血漿濃度的孕酮[3]，犬排卵時(shí)卵母細(xì)胞處于生發(fā)泡（Germinal vesicle，GV）期，在輸卵管中恢復(fù)與完成減數(shù)分裂[4]。人以及其他許多哺乳動(dòng)物可以通過人工授精（Artificial insemination，AI）、卵母細(xì)胞體外成熟（In vitro maturation，IVM）、體外受精（In vitro fertilization，IVF）和胚胎移植（Embryo transplantation，ET）等人工輔助生殖技術(shù)（Assisted reproductive technology,ART）獲得子代[1]。據(jù)報(bào)道，犬卵母細(xì)胞發(fā)育到MII 期的平均率通常在10%～20%左右，且卵母細(xì)胞的IVM率低，輔助生殖研究進(jìn)展緩慢，制約了犬相關(guān)生物技術(shù)的發(fā)展與運(yùn)用[5]。本文根據(jù)近幾年犬相關(guān)研究數(shù)據(jù)，綜述了犬卵母細(xì)胞體內(nèi)發(fā)育及體外成熟的研究進(jìn)展。

1 犬卵母細(xì)胞的體內(nèi)成熟

在體內(nèi)，卵泡及輸卵管為犬卵母細(xì)胞的成熟提供了條件和因子，且犬卵母細(xì)胞與其周圍的顆粒細(xì)胞、輸卵管上皮細(xì)胞以及精子之間有著結(jié)構(gòu)和功能上的聯(lián)系[6]，這些細(xì)胞及其相關(guān)因子調(diào)節(jié)著卵母細(xì)胞的生長與成熟。

1.1 卵泡發(fā)育

卵泡是卵巢結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞通常在卵泡中發(fā)育成熟，但犬卵母細(xì)胞的最后成熟是在卵泡外完成的。犬卵泡發(fā)育（從原始卵泡到排卵）需要170 d，最終的卵泡生長是在排卵前60～100 d 的休情期期間開始的[7]。發(fā)情初期，卵泡直徑1.0～1.5 mm，促黃體素（luteinizing hormone，LH）峰時(shí)達(dá)到2.0～6.5 mm（平均3.5 mm），排卵時(shí)卵泡直徑為6.0～8.0 mm[5]。犬卵泡后期生長表現(xiàn)出的特異性之一是對促性腺激素的接受能力，與其他哺乳動(dòng)物相比，犬卵泡在顆粒層能非常早地獲得LH 受體，當(dāng)犬卵泡直徑達(dá)到800m，亦即達(dá)到排卵卵泡直徑的25%時(shí)就能檢測到LH 的結(jié)合位點(diǎn)，而其他物種通常在達(dá)到排卵直徑的50%時(shí)才可檢測到[5]。犬卵泡后期生長的另一個(gè)特點(diǎn)是早期黃體化。

犬卵泡發(fā)育的特征是多卵卵泡（Multi-oocytic follicles，MOF）的高發(fā)生率，在小的生長卵泡中，5%～14%（甚至40%）包含2～17 個(gè)卵母細(xì)胞[5]。由于輸卵管中收集到的卵母細(xì)胞數(shù)量有時(shí)高于卵巢表面黃體的數(shù)量，研究者認(rèn)為MOF 確實(shí)可以排卵。盡管如此，即使MOF能夠排出多個(gè)卵母細(xì)胞，仍需證實(shí)它們是否具有成熟和受精能力。在MOF 內(nèi)收集的各種卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物（Cumulus-oocyte complexes，COCs）的形態(tài)和粘液化評分有很大差異，這表明每個(gè)多卵卵泡中都包含一個(gè)高質(zhì)量的單一卵母細(xì)胞[5,8]。

犬主要的生殖特性是排卵時(shí)釋放GV 期卵母細(xì)胞。另外，排卵后卵母細(xì)胞不能立即恢復(fù)減數(shù)分裂。大多數(shù)哺乳動(dòng)物在排卵前幾小時(shí)，LH峰誘發(fā)卵丘粘液化和卵母細(xì)胞減數(shù)分裂（從GV 期到MII 期）。與其他哺乳動(dòng)物相比，LH 峰的功能在犬上表現(xiàn)出更多的不同，LH 峰值持續(xù)24～72 h，LH 峰值和排卵之間的延遲大約在36～50 h[5]。

與其他哺乳動(dòng)物一樣，犬科動(dòng)物COCs 的粘液化發(fā)生在LH 峰后不久，即在卵泡直徑為4.0～4.5 mm 時(shí)可獲得粘液化能力。這種粘液化的一個(gè)特點(diǎn)是與卵母細(xì)胞緊密接觸的2～3 層顆粒細(xì)胞在排卵后2～3 d內(nèi)仍不會(huì)粘液化[5]。這表明，卵丘細(xì)胞在犬卵母細(xì)胞晚期減數(shù)分裂恢復(fù)中發(fā)揮重要作用。

1.2 排卵

確定排卵的確切時(shí)間是確保卵母細(xì)胞和胚胎生物學(xué)準(zhǔn)確性的關(guān)鍵步驟。在犬中，使用陰道涂片法、血液LH檢測（或孕酮檢測）法、超聲波檢測法等均可以判斷犬是否排卵，但超聲波診斷是目前最為常用的檢測方法。

排卵時(shí)，卵母細(xì)胞連同2～3 mL 卵泡液排到輸卵管傘中。排卵后44 h，卵母細(xì)胞位于輸卵管的近中部，但仍處于GV 期。從排卵后48 h 開始，卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂。此時(shí)，可觀察到MI 期卵母細(xì)胞，第一個(gè)完全成熟的MII 期卵母細(xì)胞大約在排卵后48～54 h 出現(xiàn)。此階段，卵母細(xì)胞具有受精能力，未成熟的卵母細(xì)胞在犬體內(nèi)也具備受精能力，但比例很低。在排卵后92～127 h 可觀察到一些退化的MII 期卵母細(xì)胞在排卵后7 d，一些卵母細(xì)胞被證明仍具有受精能力。排卵后的第9 d，受精能力喪失[5]。

有報(bào)道表明，在哺乳動(dòng)物減數(shù)分裂的傳統(tǒng)模型中，顆粒細(xì)胞通過橫向突起在卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中維持高濃度cAMP 直至LH 峰，高濃度cAMP 致使DNA 發(fā)生去凝縮（即抑制減數(shù)分裂恢復(fù)）[8]。LH 峰后，突起縮回，卵母細(xì)胞內(nèi)的cAMP 濃度下降，使得減數(shù)分裂得以恢復(fù)[5-9]。LH 峰后卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞膜的解偶聯(lián)觸發(fā)減數(shù)分裂的恢復(fù)。在犬COCs 中，放射冠中的細(xì)胞通過透明帶發(fā)出連接到達(dá)卵母細(xì)胞膜，卵母細(xì)胞膜甚至可以內(nèi)陷達(dá)到細(xì)胞核附近[10]。經(jīng)觀察，這些細(xì)胞在排卵后2～3 d 仍然牢固地附著于透明帶；在超微水平下，橫向突起排卵后2 d 開始退化，在排卵后3 d 完全消失。當(dāng)卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中自發(fā)脫落時(shí)，減數(shù)分裂恢復(fù)和中期比率增加。因此，犬與其他哺乳動(dòng)物一樣，顆粒細(xì)胞在其恢復(fù)減數(shù)分裂的過程中發(fā)揮核心作用，但不是以cAMP 作為主要介質(zhì)，因?yàn)樵隗w外中期率的增加不是因?yàn)榕囵B(yǎng)液中加入了蛋白激酶A抑制劑RpAMPc 或cAMP 類似物-二丁?；?；在減數(shù)分裂恢復(fù)的過程中，犬血液中孕酮濃度顯著增高（10～20 ng/mL）[5]，推測孕酮可能在犬卵母細(xì)胞核成熟過程中發(fā)揮重要作用。而另一些研究表明，孕酮在犬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)過程中不發(fā)揮作用，因?yàn)樵贗VM 培養(yǎng)基中添加孕酮后沒有出現(xiàn)減數(shù)分裂完成率增加的現(xiàn)象。因此，應(yīng)進(jìn)一步研究孕酮對犬卵母細(xì)胞成熟的作用。減數(shù)分裂恢復(fù)的延遲可能是由于犬卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中缺乏某些因子，要么是在輸卵管液中發(fā)現(xiàn)的因子，要么是卵母細(xì)胞自身合成的因子。與其他哺乳動(dòng)物一樣，在排卵過程中，犬卵母細(xì)胞無轉(zhuǎn)錄活性。已證明，與轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)的核仁結(jié)構(gòu)在排卵后27～33 h 之間發(fā)生了重構(gòu)。在減數(shù)分裂之前激活基因，對于更好地理解犬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的機(jī)制是非常重要的[5]。

2 體外成熟

胚胎移植（ET）、體外受精（IVF）以及輔助生殖（ART）等犬繁殖相關(guān)技術(shù)較其他哺乳動(dòng)物而言發(fā)展緩慢[11]，主要是因?yàn)槿纳成砼c其他動(dòng)物相比具有特異性。王倫學(xué)等[12]研究發(fā)現(xiàn)，犬卵母細(xì)胞的體外成熟率較低，犬卵巢排出的卵母細(xì)胞處于GV期，減數(shù)分裂的恢復(fù)發(fā)生在輸卵管中。研究還發(fā)現(xiàn)，有0%～58%的犬卵母細(xì)胞可以恢復(fù)減數(shù)分裂，而平均約20%的卵母細(xì)胞能發(fā)育至MII 期。試驗(yàn)或是生產(chǎn)過程中，胚胎移植和體外受精等都需要大量成熟卵母細(xì)胞。而犬卵母細(xì)胞的質(zhì)量對其體外成熟及核移植后的胚胎發(fā)育影響較大[13]。由于犬卵母細(xì)胞體外成熟機(jī)理的特異性，其體外成熟體系與其它家畜相比仍有待完善。目前，犬卵母細(xì)胞體外成熟的培養(yǎng)液多借鑒于其它動(dòng)物，很少或是沒有考慮到犬的種屬特異性[12]。目前，已有較多的研究嘗試從多個(gè)方面對影響犬卵母細(xì)胞體外成熟的因素進(jìn)行探討，以完善其體外培養(yǎng)系統(tǒng)，提高犬卵母細(xì)胞體外成熟效率。

2.1 影響因素

2.1.1 卵母細(xì)胞自身形態(tài)與體外成熟的關(guān)系 犬與其他哺乳動(dòng)物一樣，卵母細(xì)胞的成熟與細(xì)胞直徑有關(guān)，因此選擇大小合適的犬卵母細(xì)胞做試驗(yàn)材料，對其體外成熟的研究極為重要[14]。Hewitt 等[15]發(fā)現(xiàn)，直徑＞100m的卵母細(xì)胞成熟能力大于直徑＜100m的卵母細(xì)胞。T Otoi 等[16]的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂能力與其直徑大小成正比；直徑＜110m 的卵母細(xì)胞發(fā)育達(dá)不到MⅡ期，而卵母細(xì)胞直徑一旦達(dá)到120m 就能獲得減數(shù)分裂能力。這標(biāo)志著犬卵母細(xì)胞的直徑可作為衡量IVM 效率的一個(gè)重要指標(biāo)[12]。

Metcalfe S S 等[17]發(fā)現(xiàn)，犬卵巢中約20%～68%的卵母細(xì)胞會(huì)發(fā)生形態(tài)退化，嚴(yán)重影響犬卵母細(xì)胞的體外成熟。Farstad W 等[18]的研究表明，卵母細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量是制約犬卵母細(xì)胞體外成熟的重要因素之一。因此，犬卵母細(xì)胞體外成熟試驗(yàn)應(yīng)該選擇大量的較高質(zhì)量的卵母細(xì)胞。

2.1.2 供體對卵母細(xì)胞體外成熟的影響 有關(guān)供體犬卵母細(xì)胞的體外成熟能力與供體的年齡及其采集卵母細(xì)胞時(shí)犬所處的生殖生理階段之間的關(guān)系的研究結(jié)果報(bào)道不一致[19]。Hewvit 等[15]通過體外培養(yǎng)不同年齡的供體犬的卵母細(xì)胞并監(jiān)測它們的核成熟，結(jié)果表明，從特定大小的卵泡中采集的卵母細(xì)胞才有能力獲得體外成熟；通過比較1～6 歲組和7 歲及其以上年齡組的犬卵母細(xì)胞體外成熟能力時(shí)發(fā)現(xiàn)，6 歲以下供體犬卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)成熟的潛力更高，隨著年齡增大，卵巢組織會(huì)嚴(yán)重老化，卵母細(xì)胞獲取數(shù)量及質(zhì)量也會(huì)隨之降低，減數(shù)分裂能力減小[1,15]。Rodirgues等[20]發(fā)現(xiàn)，犬卵母細(xì)胞的體外成熟不受供體犬生殖階段的影響。更多的研究認(rèn)為，生殖周期是影響犬卵母細(xì)胞體外成熟的關(guān)鍵因素之一，發(fā)情期供體犬的卵巢獲得的卵母細(xì)胞體外成熟能力更強(qiáng)，可能與卵泡內(nèi)含有高濃度的雌激素、孕酮及一些未知因子有關(guān)。Luvoni GC 等[21]發(fā)現(xiàn)，卵泡期犬卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂和達(dá)到MI 期、MII 期的能力高于乏情期。Yamada 等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，雖然生殖周期對犬卵母細(xì)胞體外成熟有一定的影響，但并不是關(guān)鍵因素之一。Evecen 等[23]采集了儲(chǔ)存在不同溫度（4℃和37℃）的乏情期、發(fā)情期和黃體期卵巢的卵母細(xì)胞，培養(yǎng)在相同的環(huán)境條件下。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，卵巢儲(chǔ)存在37℃的情況下，發(fā)情期和黃體期組卵巢的卵母細(xì)胞體外成熟率要高于乏情期組；卵巢儲(chǔ)存在4℃的情況下，乏情期組卵巢的卵母細(xì)胞體外成熟率要高于黃體期組；另外，乏情期組卵巢儲(chǔ)存在4℃的情況下其卵母細(xì)胞體外成熟率要高于其儲(chǔ)存在37℃的情況下，但是，發(fā)情期和黃體期組卵巢的卵母細(xì)胞在4℃和37℃的儲(chǔ)存情況下其體外成熟率無顯著差異。因此，該試驗(yàn)的結(jié)果顯示，卵巢儲(chǔ)存溫度-發(fā)情周期的交互作用也影響了卵母細(xì)胞成熟率。

2.1.3 卵丘細(xì)胞與體外成熟的關(guān)系 卵母細(xì)胞成熟是當(dāng)前動(dòng)物生物技術(shù)的關(guān)鍵問題。為了提高犬卵母細(xì)胞體外成熟率，研究者通過驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞的體積、胞質(zhì)顏色等對核體外成熟有一定的影響。Otoi 等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，直徑＜100m 的卵丘卵母細(xì)胞成熟率僅為4% ～10%。Songsasen 等[25]發(fā)現(xiàn)，僅有一層顆粒細(xì)胞的犬卵母細(xì)胞培養(yǎng)至48 h 后發(fā)生退化。卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞緊密連接形成COCs，卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞間發(fā)生著復(fù)雜的信號傳遞，從而對卵母細(xì)胞的發(fā)育實(shí)現(xiàn)分子水平的調(diào)控[3]。卵丘細(xì)胞擴(kuò)展在犬上表現(xiàn)出特殊性[12]。Rodrigues 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，犬卵母細(xì)胞體外成熟時(shí)卵丘細(xì)胞很少發(fā)生擴(kuò)展。多數(shù)研究者發(fā)現(xiàn)，犬卵丘細(xì)胞擴(kuò)展與其卵母細(xì)胞的體外成熟不成正比關(guān)系[27]。N Songsasen 等[28]發(fā)現(xiàn)，GH能刺激犬卵母細(xì)胞中卵丘擴(kuò)展，但對于提高犬卵母細(xì)胞體外成熟率影響不大。不同研究結(jié)果的出現(xiàn)可能與生長因子對犬科動(dòng)物卵母細(xì)胞及卵丘細(xì)胞的影響不同有關(guān)[12]。

2.1.4 培養(yǎng)條件對體外成熟的影響 犬在GV 期排卵，經(jīng)過48～72 h 在輸卵管遠(yuǎn)端成熟。由于與其他家養(yǎng)哺乳動(dòng)物的這些差異，犬卵母細(xì)胞IVM的效率非常低。研究顯示，不同的培養(yǎng)基對犬卵母細(xì)胞成熟率的影響差異顯著。N Songsasen 等[28]的研究表明，犬卵母細(xì)胞在無蛋白培養(yǎng)基中能完成核體外成熟。Oh HJ等[29]研究不同發(fā)情期犬血清對從不同生殖狀態(tài)（卵泡，黃體或衰老期）卵巢中獲得的犬卵母細(xì)胞體外成熟的作用，研究表明，用10%犬發(fā)情血清補(bǔ)充培養(yǎng)基可改善犬卵母細(xì)胞的體外成熟。另外，犬卵母細(xì)胞對卵巢儲(chǔ)存溫度以及卵母細(xì)胞培養(yǎng)溫度非常敏感。潘和平等[30]在蘭州土狗卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體的顆粒細(xì)胞擴(kuò)展時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體體外培養(yǎng)在37.0℃組要好于在36.5 ℃組。HSLEE 等[31]將犬卵巢分別儲(chǔ)存在4 ℃和38 ℃5 h 后采集不同儲(chǔ)存溫度的卵母細(xì)胞，并分別將其培養(yǎng)在38℃溫度條件下培養(yǎng)，觀察其在不同培養(yǎng)時(shí)間體外培養(yǎng)的卵母細(xì)胞的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4 ℃組和38 ℃組的卵母細(xì)胞活力在0～4 h 之間差異不顯著（活力分別為79.6%和83.9%），但在24 h 和48 h后卵母細(xì)胞的活力有顯著差異（24 h 分別為13.2%和77.8%；48 h 分別為0%和72.9%）。

2.1.5 其他因子對體外成熟的影響 向培養(yǎng)體系中補(bǔ)充一些因子或是某些激素對卵母細(xì)胞體外成熟有一定的作用。人絨毛膜促性腺激素（Human chorionic gonadotroin，hCG）在犬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)過程中的作用顯著，Monica 等[32]在體外分段培養(yǎng)的前48 h（總培養(yǎng)時(shí)間為96 h）添加適量hCG，與對照組相比，卵母細(xì)胞的體外成熟率明顯增高。有研究表明，在培養(yǎng)體系中添加適宜濃度的雌激素或孕激素對提高犬卵母細(xì)胞的體外成熟率有顯著的影響[33]。N Songsasen 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，減數(shù)分裂抑制劑Roscovitine 對犬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的抑制能力不顯著，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，dbcAMP能夠顯著抑制犬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)能力。在IVM 培養(yǎng)基中補(bǔ)充-巰基乙醇（ -mercaptoethanol，-ME）和表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）可以改善IVF 后卵母細(xì)胞的體外成熟和胚胎發(fā)育[12,34]。這兩種化合物的作用被認(rèn)為是通過合成谷胱甘肽（GSH）來介導(dǎo)的，GSH 在保護(hù)細(xì)胞或胚胎免受氧化損傷方面發(fā)揮重要作用。KimMK等[34]在犬卵母細(xì)胞體外成熟研究試驗(yàn)中向犬卵母細(xì)胞IVM 培養(yǎng)基中補(bǔ)充 -ME 或EGF，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用25mol/L 或100mol/L 的 -ME 培養(yǎng)的卵母細(xì)胞發(fā)育至MI 期能力顯著增加，與其他實(shí)驗(yàn)組相比，添加50mol/L 或100mol/L -ME 培養(yǎng)的卵母細(xì)胞發(fā)育至MII 期能力顯著增加。另外，20 ng/mL EGF 能顯著促進(jìn)卵泡期犬卵母細(xì)胞發(fā)育至MII 期的能力[34]。

2.2 培養(yǎng)體系

由于犬科動(dòng)物生殖生理的特異性，目前已報(bào)道的犬、銀狐等犬科動(dòng)物卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法多采用細(xì)胞共培養(yǎng)、卵泡培養(yǎng)、液滴培養(yǎng)以及在游離輸卵管中培養(yǎng)。

2.2.1 細(xì)胞共培養(yǎng) 細(xì)胞共培養(yǎng)包括胚胎成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)、顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)和輸卵管上皮細(xì)胞共培養(yǎng)[1]。Hatoya S 等[35]利用MEF 和CEF 對犬卵母細(xì)胞的IVM、IVF和IVC的影響研究發(fā)現(xiàn)，胚胎成纖維細(xì)胞的共培養(yǎng)能增強(qiáng)犬卵母細(xì)胞細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)成熟。有研究發(fā)現(xiàn)，顆粒細(xì)胞對犬卵母細(xì)胞的體外成熟有一定促進(jìn)作用[12]。Digbo Bolamba 等[36]使用人工合成輸卵管液（SOF）培養(yǎng)基對來自腔前卵泡的卵母細(xì)胞體外成熟能力進(jìn)行評估，其研究結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中補(bǔ)充4%牛血清蛋白（BSA）能顯著促進(jìn)犬卵母細(xì)胞核成熟。一些研究者將輸卵管上皮細(xì)胞與犬卵母細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞成熟率明顯增高，但其對IVF 后的胚胎發(fā)育無明顯作用[1]。另外，研究指出，采集試驗(yàn)所需的輸卵管上皮細(xì)胞的供體母犬生殖周期及采集部位對試驗(yàn)結(jié)果有一定的影響[1]。

2.2.2 卵泡培養(yǎng) Bolamba D 等[37]指出，大部分家養(yǎng)犬的晚期腔前卵泡（APAN）和早期有腔卵泡（EAN）含有具有體外發(fā)育成熟能力的卵母細(xì)胞，且這些卵母細(xì)胞已經(jīng)獲得了排卵前卵母細(xì)胞致密的胞質(zhì)脂質(zhì)特征。將APAN 和EAN 卵泡通過膠原酶和DNA 酶處理從卵巢分離后置于培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)0h、24 h、48 h、72 h。結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h 后，來自APAN 濾泡的卵母細(xì)胞能顯著地達(dá)到MI 至MII 期（5.3%），與在0 h 觀察到的對照濾泡的百分比（0.9%）差異顯著[37]。繼續(xù)培養(yǎng)至48 h 達(dá)到MI 至MII 期的卵母細(xì)胞百分比進(jìn)一步增加（11.5%），培養(yǎng)至72 h 時(shí)發(fā)育率保持不變；培養(yǎng)24 h后，EAN 濾泡中達(dá)到MI 至MII 期的卵母細(xì)胞的百分比與對照組比沒有顯著增加，培養(yǎng)48 h 后發(fā)育率增加（8.7%），培養(yǎng)72 h 后發(fā)育率保持不變[37]。研究證明，早期卵泡內(nèi)的犬卵母細(xì)胞能夠恢復(fù)減數(shù)分裂到中期階段。

2.2.3 液滴培養(yǎng) 液滴培養(yǎng)是卵母細(xì)胞體外成熟試驗(yàn)中最常用的培養(yǎng)體系，即在適宜的溫度和濕度下，將分離得到的COCs 放在用礦物油覆蓋的培養(yǎng)液滴中培養(yǎng)，其關(guān)鍵影響因素在于培養(yǎng)COCs 的密度[1]。Otoi T等[38]對卵母細(xì)胞與培養(yǎng)基的適宜比例進(jìn)行了研究，將不同數(shù)量的COCs 在100L 成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，來自乏情期卵巢的卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂能力受培養(yǎng)的COCs 的密度影響較大，而來自發(fā)情期卵巢的卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂能力受培養(yǎng)的COCs的密度影響較小。

2.2.4 在游離輸卵管中培養(yǎng) Luvoni GC等[39]將采集的犬卵母細(xì)胞在輸卵管峽部-壺腹部中置于培養(yǎng)液中培養(yǎng)，試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)30 h，結(jié)扎輸卵管組的卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂的比例（63.8%）高于下降組（20.4%）或開放輸卵管組（27.1%）（P<0.001）。培養(yǎng)24 h 和30 h，減數(shù)分裂恢復(fù)比例高于48 h（分別為69.2%和59.1%比35.8%，P<0.005）。卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)主要由減數(shù)分裂前的卵母細(xì)胞決定，而結(jié)扎輸卵管后MI和MII 期占12.5%～31.9%。與24 h 和30 h 的培養(yǎng)（分別為18.7 和27.3%）相比，培養(yǎng)時(shí)間延長至48 h后，顯著增加了卵母細(xì)胞的退化（59.3%），且輸卵管上皮表現(xiàn)出培養(yǎng)后的核損傷和變性。研究表明，將犬卵母細(xì)胞置于游離輸卵管中培養(yǎng)，減數(shù)分裂在培養(yǎng)的30 h內(nèi)即恢復(fù)，對犬卵母細(xì)胞的成熟影響顯著。此外，與較傳統(tǒng)液滴培養(yǎng)或開放輸卵管培養(yǎng)相比，在游離輸卵管培養(yǎng)30 h 的卵母細(xì)胞存活率更高，但結(jié)扎的輸卵管不能保證培養(yǎng)至48 h 的卵母細(xì)胞存活率。

3 展望

由于犬生殖生理的獨(dú)特性，犬繁殖相關(guān)技術(shù)較其他動(dòng)物發(fā)展緩慢，尤其國內(nèi)對犬卵母細(xì)胞體外成熟的相關(guān)研究較少，犬卵母細(xì)胞體外成熟也成為限制犬IVF、ET 等繁殖技術(shù)發(fā)展的重要原因之一[5]。因此，應(yīng)通過研究犬卵母細(xì)胞體外成熟的相關(guān)機(jī)理及技術(shù)來提高犬卵母細(xì)胞體外成熟率，為犬科動(dòng)物輔助生殖的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。在其他哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞體外成熟研究的基礎(chǔ)上開拓新思路，采用先進(jìn)技術(shù)來優(yōu)化犬卵母細(xì)胞體外成熟體系[12]。據(jù)2005年已發(fā)布的犬全基因組序列數(shù)據(jù)，犬基因組與人的相似性達(dá)95.7 %[40]，且有研究表明，犬的多種遺傳疾病與人相似。因此，深入研究犬科動(dòng)物繁殖生物學(xué)的分子機(jī)制和人工調(diào)控方法，可以為創(chuàng)制人類疾病的犬科動(dòng)物模型提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持，對進(jìn)一步提高人類醫(yī)療保健水平以及拯救瀕危犬科動(dòng)物都具有重要意義[1]。