王慶凱，崔茂盛，楊 凌，趙子墨，付永利，張 丹，唐佩娟，李千軍*

（1.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津300381；2.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北邯鄲 056038；3.天津市畜牧總站，天津 100125；4.天津市動物疫病預防控制中心，天津 100125）

獲取高質(zhì)量的體外培養(yǎng)卵母細胞是成功實現(xiàn)動物體外胚胎生產(chǎn)和克隆的關鍵因素。長期以來，卵母細胞體外培養(yǎng)的研究重點主要集中在提高卵母細胞的成熟效果，在卵丘細胞方面上研究較少。事實上，卵丘細胞對于卵母細胞的成熟起到很大的作用。一些研究證明，與體內(nèi)成熟的卵母細胞相比，體外成熟的卵母細胞經(jīng)歷體外受精后的著床前胚胎發(fā)育能力顯著降低[1]。目前認為，體外培養(yǎng)胚胎發(fā)育能力降低可能是由于體外培養(yǎng)的卵母細胞胞質(zhì)成熟不充分造成[2]。此外，一些學者也證明了體外成熟裸卵的發(fā)育能力差是由胞質(zhì)成熟不完善造成[3]。報道稱用卵母細胞與卵丘細胞進行共培養(yǎng)可以促進卵母細胞的成熟和后期胚胎發(fā)育能力[4]，但是目前其作用機制研究不多。因此，研究卵丘細胞在體外培養(yǎng)過程中對卵母細胞成熟效果的影響及作用機制顯得十分重要。本實驗旨在研究卵丘細胞對卵母細胞體外成熟效果和對孤雌胚胎發(fā)育潛能的影響及卵丘細胞對卵母細胞谷胱甘肽（GSH）合成相關基因的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和藥品 Medium 199（美國Gibco 公司）；微量 RNA 提取試劑盒（德國Qiagen 公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR 試劑盒（美國GeneCopoeia 公司）；在無特殊說明的情況下，細胞培養(yǎng)所需其他試劑均購自Sigma 公司。

1.2 卵巢來源 豬卵巢取自天津市西青區(qū)屠宰場，屠宰后將卵巢置于37℃含有雙抗的生理鹽水中，2～4 h 內(nèi)運回實驗室。

1.3 卵母細胞采集 將帶回的卵巢用剪刀去除周邊結(jié)締組織，然后用含有雙抗的37℃生理鹽水清洗3～5 次，然后用10 mL 注射器抽取直徑為2～8 mm 的卵泡放入離心管中，待其沉淀后，洗卵，并挑出卵丘在3 層及以上、卵母細胞胞質(zhì)黑色均一的卵丘-卵母細胞復合體（COCs）用于實驗。卵泡分級如圖1 所示。

圖1 豬卵巢中的卵泡分級

1.4 卵丘細胞的制備 參考黃承俊等[5]的研究，將收集的COCs 放到0.1%透明質(zhì)酸酶中捶打，脫去卵丘細胞，然后將裸卵移出，剩余液體離心，再用成熟液離心洗滌2 次，加入成熟液使其終密度在1×106～2×106個/mL。

1.5 卵母細胞體外成熟和孤雌激活

1.5.1 COCs 的成熟培養(yǎng) COCs 采用微滴培養(yǎng)法進行培養(yǎng)，制作100 μL 成熟培養(yǎng)滴，蓋上石蠟油，提前5 h放入培養(yǎng)箱平衡，每滴中放20～30 枚卵母細胞。

1.5.2 卵丘細胞與裸卵共培養(yǎng) 取之前制備好的卵丘細胞50 μL，加入到平衡過的50 μL 成熟培養(yǎng)滴中，繼續(xù)平衡5 min，然后放入裸卵。

1.5.3 裸卵培養(yǎng) 將COCs 放入到透明質(zhì)酸酶中捶打，待卵丘細胞脫落后，獲得裸卵，然后用成熟洗滴洗2次，然后放入到成熟微滴中，將成熟盤放入到39℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5.4 孤雌激活 體外培養(yǎng)成熟后，將卵母細胞放入透明質(zhì)酸酶中吹打以至于卵丘細胞脫落，然后將卵母細胞過激活液洗滌3 次，放入融合槽內(nèi)，1.2 kv/cm、30 μs、一次脈沖。移出后在胚胎發(fā)育液（PZM-3）中洗滌3 次，然后轉(zhuǎn)入至胚胎發(fā)育盤中，每滴15～20 枚卵母細胞。

1.6 GSH 合成相關基因檢測 每組收集100 枚GV 期卵母細胞，利用微量RNA 提取試劑盒提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明獲得cDNA，將所得cDNA按照熒光定量PCR 試劑盒說明加入反應體系，反應參數(shù)：95℃預變性 3 min，95℃變性15 s；56℃退火30 s；72℃延伸30 s（40 個循環(huán)），最后72℃延伸5 min，每個樣品每次設3 個復孔。引物序列見表1。

表1 谷胱甘肽合成相關基因序列

1.7 實驗設計 實驗分COCs 組、卵丘細胞與卵母細胞共培養(yǎng)組、裸卵組。將各組卵母細胞經(jīng)體外培養(yǎng)42 h后統(tǒng)計各組的存活數(shù)及極體數(shù)，并檢測各組中GSH 代謝相關基因的表達，將各組卵母細胞經(jīng)電激活后放入PZM-3 中培養(yǎng)，48 h 后檢查卵裂率，第5 天檢查囊胚率。

1.8 統(tǒng)計分析 采用2-△△Ct法計算目的基因相對表達量，應用SPSS 11.5 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素ANOVA 分析，使用LSD 法進行多重比較，所有數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示。P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵丘細胞對豬卵母細胞存活率的影響 由表2 可知，COCs 組存活率高于裸卵組（P＜0.05），COCs 組和共培養(yǎng)組間差異不顯著。

2.2 卵丘細胞對豬卵母細胞成熟率的影響 由表3 可知，COCs 組第一極體率高于共培養(yǎng)組和裸卵組（P＜0.05），共培養(yǎng)組第一極體率高于裸卵組（P＞0.05）。

2.3 卵丘細胞對豬孤雌激活效果的影響 由表4 可知，COCs 組卵裂率和囊胚率高于共培養(yǎng)組和裸卵組（P＜0.05），共培養(yǎng)組又高于裸卵組（P＜0.05）。

表2 卵丘細胞對豬卵母細胞存活率的影響

表3 卵丘細胞對豬卵母細胞成熟率的影響

圖2 極體染色

表4 卵丘細胞對豬孤雌激活效果的影響

2.4 卵丘細胞對卵母細胞GSH 合成相關基因的影響如圖3 所示，與COCs 組相比，裸卵組顯著下調(diào)了GCLM、GCLC 的表達，共培養(yǎng)組中GCLM 的表達與COCs 組相比差異不顯著。

3 討 論

縫隙連接存在于卵丘細胞與卵母細胞之間，其完整與否影響著卵母細胞的成熟[6]。魯金花[7]研究表明，脫卵丘操作嚴重損傷了兔卵母細胞，導致卵母細胞不成熟，但脫卵丘操作不影響小鼠卵母細胞。本實驗通過透明質(zhì)酸酶來脫除卵丘細胞獲得裸卵，縫隙連接已經(jīng)受到損壞，卵丘細胞與卵母細胞間的連接機制出現(xiàn)問題[8]，通過后期裸卵的發(fā)育能力強弱可表明縫隙連接完整的重要性。卵母細胞通過分泌有效的生長因子介導卵丘細胞分化，卵丘細胞則通過縫隙連接傳遞信號并在卵泡發(fā)育的后期階段支持卵母細胞的生長，促進卵母細胞成熟和受精[9]。卵丘細胞可以提高卵母細胞凍融后的存活率和受精率并支持卵母細胞的體外成熟[10]，當兩者間的縫隙連接受到破壞時，兩者間的協(xié)調(diào)就會中斷，從而影響卵母細胞的整體發(fā)育情況[11]。

圖3 卵丘細胞對卵母細胞GSH 合成代謝相關基因的影響

本研究結(jié)果表明，COCs 組的存活率、第一極體率、成熟率及后期發(fā)育中卵裂率、囊胚率均顯著高于裸卵組。由此說明，在卵母細胞整個發(fā)育階段中卵丘細胞與卵母細胞的連接機制扮演了重要角色。Tanghe 等[12]研究表明，卵丘細胞在維持卵母細胞減數(shù)分裂恢復、促進卵母細胞胞質(zhì)成熟等方面具有重要作用。郝元斌[13]也證實了去除卵丘細胞后的卵母細胞整個發(fā)育指標顯著低于未去除卵丘細胞的卵母細胞。本實驗中，將卵丘細胞和卵母細胞共培養(yǎng)后，相關成熟指標和發(fā)育指標低于COCs組，因為卵丘細胞與卵母細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中，卵丘細胞與卵母細胞間的縫隙連接可能已經(jīng)受到破壞；但共培養(yǎng)組的極體率和胚胎后期發(fā)育指標高于裸卵組。表明在成熟液中添加分散的卵丘細胞時，會提升裸卵的發(fā)育潛能，并且旁分泌機制作用在卵母細胞體外培養(yǎng)過程中發(fā)揮了重要作用。Hashimoto 等[14]研究也表明，在成熟液中添加卵丘細胞能提高卵母細胞的發(fā)育潛能。任文娟等[15]也研究表明，與卵丘顆粒細胞復合體共培養(yǎng)可以提高ICSI 治療周期中所獲未成熟卵的體外成熟率和優(yōu)質(zhì)胚胎率。

卵母細胞合成GSH 是其成熟的關鍵部分，GSH 主要參與抗氧化及抵抗活性氧（ROS），可消除氧化自由基對細胞造成氧化損傷[16]。本實驗在成熟液添加了半胱氨酸，半胱氨酸是卵母細胞體外成熟過程中進行GSH 合成所必需的外源底物[17]。Li 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在牛體外成熟過程中，卵丘細胞有利于卵母細胞攝取半胱氨酸；且Ozawa 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，人為去除卵丘細胞可降低胞內(nèi)GSH 含量，推測卵母細胞外層的卵丘細胞可能通過縫隙鏈接（GJCs）促進卵母細胞積累GSH。

Takahashi 等[20]研究表明，胚胎能夠利用卵丘顆粒細胞代謝胱氨酸后向培養(yǎng)液中釋放的物質(zhì)來進行GSH合成。本實驗結(jié)果表明，裸卵組中GCLC、GCLM 的表達顯著低于COCs 組，并且共培養(yǎng)組中GSH 合成相關基因GCLM 的表達顯著高于裸卵組。由此可推斷，隨著卵丘細胞的減少和縫隙連接的破壞，會造成GSH 合成相關基因的表達降低，從而影響卵母細胞內(nèi)的GSH合成。

4 結(jié) 論

在成熟液中添加分散的卵丘細胞時，會提升裸卵的發(fā)育潛能；隨著卵丘細胞的減少和縫隙連接的破壞，會造成GSH 合成基因表達降低，從而影響卵母細胞內(nèi)的GSH 合成。