王兆琛 趙勇超 杜 煒 張 宇 張家新* 安 磊

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193)

顆粒細(xì)胞的快速增殖是處在發(fā)育中的優(yōu)勢(shì)卵泡的特征之一。與壁層顆粒細(xì)胞相比，卵丘(顆粒)細(xì)胞富含更多與細(xì)胞增殖和代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本。壁層顆粒細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用較少，卵泡吸收的葡萄糖則主要由卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(Cumulus-oocyte complexes, COCs)代謝。

雙調(diào)蛋白(Amphiregulin, AREG)作為一種表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal growth factor, EGF)類(lèi)因子，最初在壁層顆粒細(xì)胞中表達(dá)，然后在壁層顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞上結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor, EGFR)并激活下游信號(hào)通路。在卵泡發(fā)育過(guò)程中，卵丘細(xì)胞獲得功能性的EGFR信號(hào)是一個(gè)里程碑性的事件，排卵前卵泡液中的AREG含量也與卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力密切相關(guān)。另外，有研究表明卵母細(xì)胞分泌因子(Oocyte-secreted factors, OSFs)，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(Bone morphogenetic protein 15, BMP15)和生長(zhǎng)分化因子9(Growth differentiation factor 9, GDF9)，通過(guò)SMAD2/3途徑促進(jìn)卵丘細(xì)胞上EGFR的表達(dá)。

卵丘細(xì)胞的葡萄糖代謝對(duì)卵母細(xì)胞的成熟以及受精后的胚胎發(fā)育潛能至關(guān)重要，卵丘細(xì)胞通過(guò)間隙連接通訊(Gap-junctional communication, GJC)將葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)卵母細(xì)胞或者為卵母細(xì)胞提供可利用的底物。卵丘細(xì)胞通過(guò)糖酵解和磷酸戊糖途徑(Pentose phosphate pathway, PPP)代謝葡萄糖支持卵母細(xì)胞成熟，并且通過(guò)PPP產(chǎn)生的NADPH對(duì)于卵母細(xì)胞的抗氧化功能尤為重要。在綿羊的研究中發(fā)現(xiàn)，卵丘細(xì)胞糖酵解、PPP的激活以及卵母細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的改善可能有利于卵母細(xì)胞的成熟。此外，AREG可以促進(jìn)牛COCs糖酵解，AREG與OSFs結(jié)合可以提高卵母細(xì)胞內(nèi)的NADPH水平及體外受精后的胚胎發(fā)育能力。

在綿羊體外胚胎生產(chǎn)中，來(lái)源于小腔卵泡的卵母細(xì)胞不能被有效的利用，其中一個(gè)主要原因是小腔卵泡卵母細(xì)胞的體外成熟(

In

vitro

maturation, IVM)質(zhì)量較差，發(fā)育能力較低。近年來(lái)，有許多研究針對(duì)卵丘細(xì)胞分析不同直徑腔卵泡之間細(xì)胞增殖、代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的差異，普遍認(rèn)為小腔卵泡的卵丘細(xì)胞上EGFR信號(hào)通路沒(méi)有被充分激活，限制了卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。在多種動(dòng)物上的研究表明，AREG等EGF類(lèi)因子激活COCs中卵丘細(xì)胞的EGFR信號(hào)通路，提高了卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量。但在綿羊卵丘細(xì)胞上，還沒(méi)有研究證明不同直徑腔卵泡卵丘細(xì)胞葡萄糖代謝的差異，以及AREG對(duì)葡萄糖代謝的影響，且COCs的研究無(wú)法排除卵母細(xì)胞對(duì)卵丘細(xì)胞的影響。因此，本研究以綿羊卵丘細(xì)胞為研究對(duì)象，為來(lái)源于中、小腔卵泡的卵丘細(xì)胞提供相同的OSFs條件，探究AREG對(duì)中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞葡萄糖代謝的影響，為綿羊卵母細(xì)胞成熟機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1

.

1

.

1

動(dòng)物樣品

自屠宰場(chǎng)收集的綿羊離體卵巢需保存在含有青霉素和鏈霉素的無(wú)菌生理鹽水中，于保溫瓶保持溫度在30～35 ℃，4 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1

.

1

.

2

試劑與藥品

TCM-199基礎(chǔ)培養(yǎng)液、胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和青鏈霉素合劑(Penicillin-strepto，PS)購(gòu)自于Gibco公司，AREG、GDF9和BMP15購(gòu)自于R&D Systems公司，促卵泡素(FSH)購(gòu)自于Bioniche公司，CCK-8購(gòu)自于北京全式金生物技術(shù)公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，葡萄糖測(cè)定試劑盒購(gòu)自于上海榮盛生物技術(shù)公司，NADPH檢測(cè)試劑盒和乳酸檢測(cè)盒購(gòu)自于南京建成生物工程研究所，增強(qiáng)型ATP檢測(cè)試劑盒購(gòu)自于上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1

.

2

.

1

COCs的采集

試驗(yàn)所需綿羊卵巢取自呼和浩特屠宰場(chǎng)。將綿羊卵巢用含有1%青鏈霉素合劑的生理鹽水清洗。在卵巢表面分別選取直徑2～6 mm的中腔卵泡和直徑<2 mm的小腔卵泡，使用帶有9#、7#針頭的10 mL注射器分別抽取中、小腔卵泡內(nèi)容物。于體視顯微鏡下挑選抽取獲得的COCs，選擇胞質(zhì)均勻且外周包裹有3層以上卵丘細(xì)胞的COCs，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1

.

2

.

2

卵丘細(xì)胞的分離培養(yǎng)

將50枚COCs用震蕩器震蕩5 min后，收集分散的卵丘細(xì)胞, 在1 350 r/min下離心5 min，除去上清。然后用培養(yǎng)液離心洗滌2次，除去上清后用培養(yǎng)液將細(xì)胞重懸, 接種到培養(yǎng)皿中于 37 ℃，5% CO2，95%空氣，飽和濕度下培養(yǎng)。培養(yǎng)液為: TCM-199培養(yǎng)基+10% FBS +1% PS。按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)在培養(yǎng)液中添加0、5、10、50、100 ng/mL的AREG；添加或不添加0.5個(gè)/μL DOs、100 ng/mL GDF9和100 ng/mL BMP15。

1

.

2

.

3

卵母細(xì)胞的體外成熟

基礎(chǔ)成熟液是TCM-199+10 μg/mL FSH+3 mg/mL BSA+1%PS，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在基礎(chǔ)成熟液中分別添或不添加100 ng/mL AREG、GDF9及BMP15。每20枚COCs放入100 μL成熟液滴中，38.6 ℃，5% CO，95%空氣，飽和濕度下培養(yǎng)24 h。

1

.

2

.

4

試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究分別利用分離的卵丘細(xì)胞和COCs開(kāi)展試驗(yàn)(表1)。在試驗(yàn)2中為了提供卵源性O(shè)SFs添加脫光卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞(Denuded oocytes, DOs)，試驗(yàn)2、3和4中添加的GDF9和BMP15為外源性O(shè)SFs。

1

.

2

.

5

熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)收集50枚來(lái)源于不同直徑卵泡COCs中的卵丘細(xì)胞，使用Trizol抽提法提取細(xì)胞總RNA，按照PrimenScriptRT Master Mix Kit試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

G6PDH

、

PFKM

、

PFKM

和內(nèi)參基因

YWHAZ

引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列及退火溫度見(jiàn)表2。反映條件為：預(yù)變性：95 ℃ 5 min；變性：95 ℃ 30 s；退火：60 ℃ 30 s；延伸：72 ℃ 30 s；35個(gè)循環(huán)；4 ℃終止。以

YWHAZ

基因?yàn)閮?nèi)參， 根據(jù)2法計(jì)算各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1

.

2

.

6

卵丘細(xì)胞增殖的測(cè)定

當(dāng)來(lái)源于中腔卵泡或小腔卵泡的原代卵丘細(xì)胞生長(zhǎng)到80%，同時(shí)將二者消化重懸，將細(xì)胞濃度調(diào)整為 2×10個(gè)/mL，接種于96孔板內(nèi)，每孔接種100 μL。利用CCK-8試劑盒處理細(xì)胞，在培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃孵育2 h后，利用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度，按平均吸光度數(shù)值與細(xì)胞增殖成正比。

1

.

2

.

7

細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖消耗檢測(cè)

收集培養(yǎng)液，按照說(shuō)明書(shū)加入相應(yīng)試劑，充分混勻，37 ℃水浴中孵育10 min，使用酶標(biāo)儀測(cè)定505 nm波長(zhǎng)吸光度，讀取標(biāo)準(zhǔn)孔、測(cè)定孔的吸光度，分別為A標(biāo)準(zhǔn)、A 樣本。培養(yǎng)液中葡萄糖濃度=A測(cè)定/A標(biāo)準(zhǔn)×標(biāo)準(zhǔn)液濃度。原培養(yǎng)液中葡萄糖濃度-檢測(cè)培養(yǎng)液中葡萄糖濃度=消耗葡萄糖濃度。

1

.

2

.

8

乳酸生成檢測(cè)

收集培養(yǎng)液，按照說(shuō)明書(shū)加入樣本、酶工作液、顯色劑，混勻，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，37 ℃水浴10 min，使用酶標(biāo)儀測(cè)定530 nm 波長(zhǎng)吸光度，培養(yǎng)液中乳酸濃度=校準(zhǔn)液濃度×(樣本吸光度值-空白吸光度值)/(校準(zhǔn)吸光度值-空白吸光度值)。檢測(cè)培養(yǎng)液中乳酸濃度-原培養(yǎng)液中乳酸濃度=乳酸生成濃度。

1

.

2

.

9

培養(yǎng)液或卵母細(xì)胞中NADPH含量檢測(cè)

收集培養(yǎng)液或卵母細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)加入堿性提取液，(細(xì)胞需超聲波破碎1 min)，95 ℃水浴5 min。冰浴冷卻后，10 000 g 4 ℃離心10 min，取上清至新管中，加入等體積的酸性提取液。混勻，10 000 g 4 ℃離心10 min，取上清于冰上待測(cè)。根據(jù)試劑盒說(shuō)明依序加入試劑，使用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm波長(zhǎng)吸光值。

1

.

2

.

10

細(xì)胞內(nèi)ATP含量測(cè)定

根據(jù)ATP檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，使用ATP裂解液裂解細(xì)胞,12 000 r/min離心5 min,收集上清用于后續(xù)測(cè)定。加100 μL ATP檢測(cè)工作液到檢測(cè)孔內(nèi)。室溫放置3～5 min。然后在檢測(cè)孔內(nèi)加上20 μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，使用酶標(biāo)儀測(cè)定RLU值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每孔細(xì)胞內(nèi)ATP含量。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)分組信息
Table 1 Group information of experimental design

序號(hào)No.試驗(yàn)對(duì)象Test subjects各組細(xì)胞數(shù)量Numberof cells ineach group添加物質(zhì)Addedsubstances分組信息Group information檢測(cè)指標(biāo)Test index1分離的卵丘細(xì)胞分離自50個(gè)COCs無(wú)中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞G6PDH、PFKL和PFKM表達(dá)量細(xì)胞增殖2分離的卵丘細(xì)胞分離自50個(gè)COCsAREG、DOs、GDF9、BMP15①中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞體外培養(yǎng)分別添加0、5、10、50、100 ng/mL AREG。②中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞體外培養(yǎng)添加或不添加10 ng/mL AREG、0.5個(gè)/μL DOs、100 ng/mL GDF9和100 ng/mL BMP15。細(xì)胞增殖3分離的卵丘細(xì)胞分離自50個(gè)COCsAREG、GDF9、BMP15中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞體外培養(yǎng)添加或不添加10 ng/mL AREG、100 ng/mL GDF9和100 ng/mL BMP15。培養(yǎng)液中的葡萄糖消耗培養(yǎng)液中的乳酸生成培養(yǎng)液中的NADPH卵丘細(xì)胞內(nèi)的ATP4COCs(以COCs的結(jié)構(gòu)進(jìn)行卵母細(xì)胞IVM)60個(gè)COCsAREG、GDF9、BMP15小腔卵泡卵母細(xì)胞IVM培養(yǎng)液添加或不添加100 ng/mL AREG、100 ng/mL GDF9和100 ng/mL BMP15,中腔卵泡卵母細(xì)胞IVM培養(yǎng)液不添加上述物質(zhì)。培養(yǎng)液中的葡萄糖消耗培養(yǎng)液中的乳酸生成卵母細(xì)胞內(nèi)的NADPH卵丘細(xì)胞內(nèi)的ATP卵母細(xì)胞內(nèi)的ATP

表2 RT-PCR引物序列
Table 2 The sequence of primers used for RT-PCR

基因Gene引物序列(5′-3′)Primer sequence (5′-3′)退火溫度/℃Annealing temperatureG6PDHF: TGACCTATGGCAACCGATACAAR: CCGCAAAAGACATCCAGGAT60PFKMF: ATCCCTGCCACGGTCTCCAAR: TGCCGCTGACTGCTTGATGC60PFKLF: TTCGTGCTGGAGGTGATGGGR: CTCCCAGCCGTCCTCAGGTG60YWHAZF: TGTAGGAGCCCGTAGGTCATCTR:TTCTCTCTGTATTCTCGAGCCATCT60

1

.

2

.

11

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析所有試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，使用SAS 9.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用GLM方差分析事后Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

P

<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞葡萄糖代謝相關(guān)基因表達(dá)量及細(xì)胞增殖能力的比較

檢測(cè)中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞中PPP相關(guān)基因

G6PDH

和糖酵解相關(guān)基因

PFKL

和

PFKM

的表達(dá)量。如圖1所示，

G6PDH

、

PFKL

和

PFKM

在小腔卵泡卵丘細(xì)胞的mRNA表達(dá)量均顯著低于中腔卵泡卵丘細(xì)胞(0.905±0.036和1.105±0.038、0.751±0.047和1.334±0.052、0.806±0.025 和1.241±0.046，

P

<0.05)；來(lái)源于中腔卵泡和小腔卵泡的第二代卵丘細(xì)胞生長(zhǎng)曲線均近似“S”型，中腔卵泡卵丘細(xì)胞在前5 d(120 h)的增殖能力顯著高于小腔卵泡卵丘細(xì)胞(

P

<0.05)，且在第2天(48 h)差距最大。這些結(jié)果說(shuō)明相比于中腔卵泡卵丘細(xì)胞，小腔卵泡卵丘細(xì)胞的葡萄糖代謝能力及細(xì)胞增殖能力較弱。

(a)G6PDH、PFKL和PFKM在中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞中的表達(dá)豐度；(b)中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線；*表示顯著差異，P<0.05。(a) Expression abundance of G6PDH、PFKL and PFKM in cumulus cells from medium and small antral follicles. (b) Growth curve of cumulus cells from medium and small antral follicles. *indicate significant difference (P<0.05).圖1 中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞葡萄糖代謝相關(guān)基因表達(dá)量及細(xì)胞增值能力的比較Fig.1 Expression abundance of G6PDH、PFKL and PFKM in cumulus cells from different diameter antral follicles of sheep

2.2 AREG及OSFs對(duì)中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞增殖的影響

在第二代卵丘細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，添加0、5、10、50、100 ng/mL AREG，孵育24 h后檢測(cè)細(xì)胞增殖。如圖2(a)所示，與不添加AREG組相比，10、50 和100 ng/mL AREG顯著提高中腔卵泡卵丘細(xì)胞的增殖能力(0.633±0.009、0.689±0.015、0.691±0.011 和0.692±0.016，

P

<0.05)，50和100 ng/mL AREG顯著提高小腔卵泡卵丘細(xì)胞的增殖能力(0.400±0.003、0.436±0.006和0.445±0.007，

P

<0.05)，但仍顯著低于所有濃度組的中腔卵泡卵丘細(xì)胞(

P

<0.05)。推測(cè)AREG對(duì)中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞增殖影響的差異，是因?yàn)樾∏宦雅萋亚鸺?xì)胞上EGFR表達(dá)較低。在第二代卵丘細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，添加10 ng/mL AREG，添加或不添加DOs(提供卵源性O(shè)SFs)和GDF9+BMP15，孵育24 h后檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。結(jié)果如圖2(b)所示，添加DOs而不添加AREG，小腔卵泡卵丘細(xì)胞的增殖顯著低于中腔卵泡卵丘細(xì)胞(0.667±0.018和0.731±0.011，

P

<0.05)；添加DOs和AREG后，中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞的增殖顯著提高(0.786±0.007和0.778±0.022，

P

<0.05)，且中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞的增殖無(wú)顯著差異(

P

>0.05)；添加AREG和GDF9+BMP15培養(yǎng)的中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞，增殖能力均顯著高于添加AREG和DOs，且兩者間差異不顯著(

P

>0.05)。這說(shuō)明在滿足OSFs及AREG的條件下，中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞的增殖能力可以達(dá)到相同的水平，且GDF9和BMP15代表OSFs發(fā)揮協(xié)同的作用。

(a)不同濃度AREG對(duì)中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞增殖的影響；(b)在OSFs作用下，10 ng/mL AREG對(duì)中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞增殖的影響；G9：GDF9；B15：BMP15；不同的字母表示顯著差異，P<0.05。(a) The effect of different concentrations of AREG on the proliferation of medium and small antral follicle cumulus cells. (b) The effect of 10 ng/mL AREG on the proliferation of medium and small antral follicle cumulus cells under the effect of OSFs. G9: GDF9, B15: BMP15. Different letters indicate significant difference (P<0.05).圖2 AREG及OSFs對(duì)不同直徑卵泡的卵丘細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effects of AREG and OSFs on the proliferation of cumulus cells from different diameter antral follicles

2.3 在GDF9和BMP15的協(xié)同作用下，AREG對(duì)中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞葡萄糖代謝的影響

在第二代卵丘細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，在添加GDF9+BMP15的基礎(chǔ)上添加或不添加10 ng/mL AREG，培養(yǎng)24 h。檢測(cè)培養(yǎng)液中葡萄糖的消耗以及乳酸、NADPH的生成，檢測(cè)卵丘細(xì)胞中ATP的含量。結(jié)果如圖3所示，在不添加AREG的條件下，中腔卵泡卵丘細(xì)胞培養(yǎng)液中的葡萄糖消耗、NADPH生成、乳酸生成及卵丘細(xì)胞內(nèi)ATP含量顯著高于小腔卵泡卵丘細(xì)胞(1.000±0.092和0.790±0.065、1.000±0.107和0.250±0.058、1.000±0.047和0.797±0.068、1.000±0.023和0.790±0.042，

P

<0.05)，添加AREG顯著增加中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞的葡萄糖消耗、NADPH生成、乳酸生成及卵丘細(xì)胞內(nèi)ATP含量(1.425±0.051 和1.296±0.049、1.661±0.071和1.393±0.107、1.443±0.048和1.307±0.063、1.209±0.031 和1.099±0.04，P<0.05)，且中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞之間差異顯著(

P

<0.05)。這說(shuō)明在GDF9和BMP15的協(xié)同作用下，AREG可以增強(qiáng)中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞的葡萄糖代謝能力，但添加AREG、GDF9和BMP15后的小腔卵泡卵丘細(xì)胞的葡萄糖代謝相對(duì)小腔卵泡較低，也進(jìn)一步證明兩者葡萄糖代謝能力的差異。

2.4 IVM培養(yǎng)液中添加AREG、GDF9和BMP15可以增強(qiáng)小腔卵泡COCs的葡萄糖代謝

(a)培養(yǎng)液中葡萄糖的消耗；(b)培養(yǎng)液中乳酸的生成；(c)培養(yǎng)液中NADPH的生成；(d)卵丘細(xì)胞中ATP的含量；G9：GDF9；B15：BMP15；在各圖中不添加AREG的中腔卵泡組值標(biāo)記為1，其他各組平均值為該值的相對(duì)值，不同的字母表示顯著差異，P<0.05。(a) Relative glucose uptake in culture solution; (b) Relative lactate production in culture solution; (c) Relative NADPH production in culture solution; (d) Relative ATP concentration in cumulus cells. G9: GDF9; B15: BMP15. Within each graph, the medium group without AREG was assigned a value of one and all other means are expressed relative to this value. Different letters indicate significant difference (P<0.05).圖3 在GDF9和BMP15的協(xié)同作用下，AREG對(duì)中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞葡萄糖代謝的影響Fig.3 Effects of AREG on the glucose metabolism of cumulus cells from different diameter antral follicles under the synergistic effect of GDF9 and BMP15

為了在IVM過(guò)程中使小腔卵泡COCs的葡萄糖代謝提升到中腔卵泡水平，在小腔卵泡卵母細(xì)胞IVM培養(yǎng)液中添加AREG、GDF9和BMP15，檢測(cè)IVM后培養(yǎng)液中的葡萄糖消耗、乳酸生成以及卵母細(xì)胞中的NADPH含量。如圖4所示，與對(duì)照組相比，添加AREG、GDF9和BMP15顯著提高了小腔卵泡COCs的葡萄糖消耗、乳酸生成和卵母細(xì)胞中的NADPH含量(1.177±0.007和0.169±0.05、1.171±0.091和0.167±0.055、0.984±0.037 和0.846±0.017，

P

<0.05)。另外，添加AREG、GDF9和BMP15的小腔卵泡COCs葡萄糖消耗、乳酸生成顯著高于中腔卵泡COCs(1.177±0.007和1.000±0.07、1.171±0.091和1.000±0.039、0.984±0.037和1.000±0.020，

P

<0.05)，卵母細(xì)胞NADPH含量與中腔卵泡卵母細(xì)胞差異不顯著(

P

>0.05)。檢測(cè)IVM后卵丘細(xì)胞以及卵母細(xì)胞中的ATP含量，如圖5所示，與對(duì)照組相比，添加AREG、GDF9和BMP15顯著增強(qiáng)小腔卵泡卵丘細(xì)胞及卵母細(xì)胞內(nèi)的ATP含量(1.102±0.011 和0.629±0.127、0.991±0.026和0.721±0.022，

P

<0.05；與中腔卵泡組相比，卵丘細(xì)胞內(nèi)ATP含量顯著高于(1.102±0.011和1.000±0.018，

P

<0.05)中腔卵泡卵丘細(xì)胞，卵母細(xì)胞內(nèi)ATP含量與中腔卵泡卵母細(xì)胞差異不顯著(0.991±0.026和1.000±0.011，

P

>0.05)。這說(shuō)明AREG+GDF9+BMP15可以在IVM中提高小腔卵泡COCs的葡萄糖代謝水平。

3 討 論

近年來(lái)，許多的研究發(fā)現(xiàn)AREG作為一種EGF類(lèi)因子，可以激活卵丘細(xì)胞上的EGFR信號(hào)通路，促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟，卵母細(xì)胞分泌的OSFs也起到協(xié)同作用。Sugimura等在豬發(fā)育能力較低的小腔卵泡卵母細(xì)胞上的研究上也發(fā)現(xiàn)相同結(jié)果。不同直徑腔卵泡卵母細(xì)胞的發(fā)育能力存在差異，不僅是卵母細(xì)胞自身的問(wèn)題，也受其周?chē)亚鸺?xì)胞的調(diào)控，而不同直徑腔卵泡卵丘細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)存在著差異。例如，小腔卵泡卵丘細(xì)胞的EGFR表達(dá)較低。分離培養(yǎng)不同直徑腔卵泡的卵丘細(xì)胞，可以排除卵母細(xì)胞的影響。因此本實(shí)驗(yàn)以分離的不同直徑腔卵泡卵丘細(xì)胞為研究對(duì)象，探究他們之間的增殖代謝差異，可以幫助我們理解卵母細(xì)胞成熟的機(jī)制。

卵丘細(xì)胞的增殖能力，是細(xì)胞的重要生理功能之一，是其代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的體現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，小腔卵泡卵丘細(xì)胞的糖酵解途徑及PPP相關(guān)基因表達(dá)量較低，表明其對(duì)葡萄糖代謝的能力較低。這可能與小腔卵泡卵丘細(xì)胞上EFGR信號(hào)通路較弱有關(guān)，也與Wigglesworth等在小鼠不同直徑卵泡上的研究結(jié)果一致。卵丘細(xì)胞主要通過(guò)糖酵解產(chǎn)生ATP供給其各項(xiàng)生命活動(dòng)，并產(chǎn)生代謝產(chǎn)物如丙酮酸和乳酸。卵丘細(xì)胞還要通過(guò)PPP代謝葡萄糖產(chǎn)生NADPH，以維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡。所以小腔卵泡卵丘上較低的葡萄糖代謝可能會(huì)影響其增殖能力。丙酮酸和NADPH的供給對(duì)于卵母細(xì)胞ATP的合成及成熟至關(guān)重要，ATP含量較高的卵母細(xì)胞具有更高的受精率和囊胚發(fā)育率。另外，在檢測(cè)IVM過(guò)程中卵丘細(xì)胞PPP的強(qiáng)弱時(shí)，本研究測(cè)定了卵母細(xì)胞內(nèi)的NADPH含量而不是培養(yǎng)液中的NAPDH生成，是因?yàn)樵贑OCs中卵丘細(xì)胞產(chǎn)生的NADPH需要通過(guò)GJC傳遞給卵母細(xì)胞。

(a)培養(yǎng)液中葡萄的消耗；(b)培養(yǎng)液中乳酸的生成；(c)卵母細(xì)胞中NADPH的含量。G9：GDF9；B15：BMP15。在各圖中腔卵泡組的值標(biāo)記為1，其他各組平均值為該值的相對(duì)值。不同字母上標(biāo)表示顯著差異，P<0.05。(a) Relative glucose uptake in culture solution; (b) Relative lactate production in culture solution; (c) Relative NADPH concentration in oocytes. G9: GDF9; B15: BMP15. Within each graph, the medium group was assigned a value of one and all other means are expressed relative to this value. Different letters indicate significant difference (P<0.05).圖4 AREG、GDF9和BMP15對(duì)小腔卵泡COCs葡萄糖代謝的影響Fig.4 Effects of AREG, GDF9 and BMP15 on glucose metabolism of COCs from small antral follicles

(a)卵丘細(xì)胞內(nèi)ATP 含量；(b)卵母細(xì)胞內(nèi)ATP含量；G9：GDF9；B15：BMP15；在各圖中腔卵泡組的值標(biāo)記為1，其他各組平均值為該值的相對(duì)值；不同字母上標(biāo)表示顯著差異，P<0.05。(a) ATP concentration in cumulus cells; (b) ATP concentration in oocytes. G9: GDF9; B15: BMP15. Within each graph, the medium group was assigned a value of one and all other means are expressed relative to this value. Different letters indicate significant difference (P<0.05).圖5 AREG、GDF9和BMP15對(duì)小腔卵泡卵丘及卵母細(xì)胞內(nèi)ATP含量的影響Fig.5 Effects of AREG, GDF9 and BMP15 on cumulus cells and oocytes ATP concentration from small antral follicular COCs

對(duì)來(lái)源于不同直徑腔卵泡卵丘細(xì)胞添加了不同濃度的AREG，發(fā)現(xiàn)小腔卵泡卵丘細(xì)胞對(duì)AREG的敏感度較低，需要較大的濃度才能提高其增殖能力，但還與中等腔卵泡卵丘細(xì)胞有較大的差距?？赡芟鄬?duì)于中腔卵泡卵丘細(xì)胞，小腔卵泡卵丘細(xì)胞沒(méi)有得到OSFs的足夠刺激。由于不同直徑腔卵泡中的卵母細(xì)胞發(fā)育程度不同，OSFs水平也存在較大差異，例如小腔卵泡卵母細(xì)胞的GDF9和BMP15表達(dá)較低。本研究在不同直徑腔卵泡卵丘細(xì)胞培養(yǎng)液中同時(shí)添加了來(lái)自與中腔卵泡的卵母細(xì)胞，保證相同的OSFs供應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在GDF9和BMP15的協(xié)同作用下，AREG可以增強(qiáng)不同直徑腔卵泡卵丘細(xì)胞的增殖及葡萄糖代謝能力，且在一定程度上可以縮小中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞的差距。小腔卵泡卵丘細(xì)胞的葡萄糖代謝能力與中腔卵泡卵丘細(xì)胞還有一定的差距，可能是因?yàn)橄嗤瑒┝康腁REG和OSFs對(duì)小腔卵泡卵丘上的EGFR信號(hào)刺激還不夠。

本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)，在小腔卵泡卵母細(xì)胞IVM培養(yǎng)液中添加AREG+GDF9+BMP15，可以顯著提高卵母細(xì)胞的能量代謝水平及IVF后的胚胎發(fā)育能力。在本研究中，發(fā)現(xiàn)添加AREG+GDF9+BMP15顯著增強(qiáng)小腔卵泡COCs的葡萄糖代謝能力，并且高于中腔卵泡的水平，這可能是因?yàn)橥庠刺砑拥腁REG+GDF9+BMP15充分增強(qiáng)了小腔卵泡卵丘細(xì)胞上的EGFR信號(hào)通路，由此也增強(qiáng)了小腔卵泡卵丘細(xì)胞向卵母細(xì)胞傳遞代謝物并產(chǎn)生ATP的能力。

4 結(jié) 論

本研究表明，在GDF9和BMP15的協(xié)同作用下，AREG可以增強(qiáng)不同直徑腔卵泡卵丘細(xì)胞的增殖及葡萄糖代謝能力，在IVM培養(yǎng)液中添加AREG+GDF9+BMP15可以提高小腔卵泡COCs的葡萄糖代謝水平。本研究改善了綿羊小腔卵泡卵母細(xì)胞的IVM質(zhì)量，從而提高了綿羊卵母細(xì)胞的利用效率。本研究為家畜動(dòng)物卵泡發(fā)育的研究奠定基礎(chǔ)，說(shuō)明了AREG對(duì)卵丘細(xì)胞葡萄糖代謝的作用，而卵丘細(xì)胞的EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)其葡萄糖代謝的影響機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。