張曼，謝軍，衛(wèi)春會，王洪，李子健，羅惠波,*

1(四川理工學院 生物工程學院，四川 自貢,643000) 2(四川理工學院，釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川 自貢,643000)

大曲是以小麥為主或輔以豌豆和大麥等發(fā)酵制成的形狀較大并含有多種菌類、酶類及香味物質(zhì)的微生態(tài)制品[1]，是釀酒生產(chǎn)中的糖化發(fā)酵劑和生香劑，同時也是釀酒生產(chǎn)的部分原料。由于微生物的代謝作用使得大曲含有豐富的風味物質(zhì)及其前體物，這些風味化合物構(gòu)成了大曲自身的“曲香”[2-3]。大曲按照制曲工藝可區(qū)分為傳統(tǒng)大曲、純種大曲、強化大曲和架子曲[4]，目前，對單層曲的工藝研究較為普遍，對多層曲的研究較少，而多層曲的研究方向主要是對工藝的探討、對制曲新設(shè)備的研發(fā)等，對單雙層曲的對比研究更少。大曲的品質(zhì)與特點不僅影響其產(chǎn)酒率，且與基酒的品質(zhì)與風格息息相關(guān)[5]，大曲成分比較復(fù)雜，我國大部分白酒企業(yè)的大曲質(zhì)量標準都是根據(jù)理化指標和感官指標制定的[1,6]，雖然能在一定程度上反映出大曲的質(zhì)量，但缺乏一些科學依據(jù)，并且不同的人對同一塊大曲的感官評價可能存在差異，主觀性較強。隨著對大曲質(zhì)量標準的深入研究，設(shè)定大曲質(zhì)量標準時將理化指標、生化指標和感官指標納入標準體系[7]。為了統(tǒng)一大曲的質(zhì)量標準、用數(shù)據(jù)模型代替主觀性較強的感官評定，對單層大曲和雙層大曲的理化、生化、微生物指標進行考察很有必要。

該文主要通過測定濃香型單層曲和雙層曲在發(fā)酵過程中理化指標、生化指標、微生物量，分析其變化趨勢、差異及原因，將感官鑒定、理化指標、生化指標、微生物指標等納入因素范疇，通過打分制建立一個科學的評價體系，將傳統(tǒng)的感官鑒定與科學評價體系相結(jié)合來評價大曲質(zhì)量的好壞。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲樣品：四川邛崍古川酒廠，分別取單層曲和雙層架子曲發(fā)酵0 d、1 d、3 d、6 d、9 d、12 d、15 d、20 d、60 d(貯存1個月)、90 d(貯存2個月)的大曲，并對大曲進行相應(yīng)的編號，單層曲：S0、S1、S3、S6、S9、S12、S15、S20、S1M(貯存1個月)、S2M(貯存2個月)；雙層曲：D0、D1、D3、D6、D9、D12、D15、D20、D1M(貯存1個月)、D2M(貯存2個月)。大曲粉碎后過30目篩，混合均勻后放置4℃冰儲存用于理化指標的測定，放置在-20℃冰箱里用于微生物指標的測定。

主要試劑：α-淀粉酶(50 000 U)、糖化酶(50 000 U)：山東西亞化學工業(yè)有限公司；溶菌酶、蝸牛酶、SDS(美國Sigma公司)；DNA提取液；苯酚、氯仿、異戊醇、異丙醇、無水乙醇，分析純(成都市科龍化工試劑廠)；Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit；QIAquick Gel Extraction Kit，Quant-iTPicoGreen定量試劑盒等。

1.2 儀器與設(shè)備

GZ-1200-X型恒溫層析柜：韶關(guān)廣智科技設(shè)備有限公司；UV-1200型紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；MIK-6AT型溫濕度變送器：杭州美控自動化技術(shù)有限公司；APEG-DCO2-3-H型固定式二氧化碳檢測儀，APEG-DO2-3-H型固定式氧氣檢測儀：深圳市安帕爾科技有限公司；實時熒光定量PCR儀：TIB8600，泰普生物科學(中國)有限公司等。

1.3 方法

1.3.1 大曲理化指標的測定

水分、酸度、氨態(tài)氮含量的測定方法參照文獻[8]；水分活度使用水活度儀進行測定[9]；淀粉的測定方法根據(jù)文獻[10]測定。

1.3.2 大曲生化指標的測定

大曲液化力、酯化力、糖化力和發(fā)酵力的測定方法根據(jù)文獻[11-12]測定。

1.3.3 微生物量的測定

測定采用熒光定量實時PCR法[13]，對粗提取的基因組DNA進行純化后，進行熒光定量PCR。以大曲總基因組DNA為模板，分別以引物對338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’),806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)對細菌16S rRNA基因序列中的V3-V4可變區(qū)進行擴增，引物對ITS5F(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’),ITS1R(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)對真菌ITS1區(qū)進行擴增。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s，45個循環(huán)。

1.3.4 大曲感官鑒定綜合評定方法

結(jié)合一些研究者[6]對大曲感官鑒定的標準，對大曲感官參數(shù)的設(shè)置及其權(quán)重分配進行綜合評定，見表1。

表1 大曲感官評分表Table 1 Sensory evaluation of Daqu

對貯存1個月和2個月的單層大曲和雙層大曲進行感官打分，所得感官評分記為S。其中，感官評分由5名以上酒廠專業(yè)制曲人員進行，最終取平均值記為最終評分。

1.3.5 大曲理化和生化指標綜合評定方法

大曲理化和生化指標對大曲質(zhì)量影響較大，結(jié)合先前研究者對大曲質(zhì)量指標參數(shù)的設(shè)置及其權(quán)重分配進行綜合評定[14]，見表2。

表2 理化和生化指標參數(shù)設(shè)置及權(quán)重分配Table 2 Parameters set for physicochemical and biochemical indexes and their weights distribution

由于大曲各理化和生化指標的單位不同即量綱不統(tǒng)一，數(shù)值上差異會很大，為了消除量綱的影響，該試驗將對大曲各指標進行歸一化處理，其計算公式為：

(1)

大曲酸度、液化力、糖化力、發(fā)酵力、酯化力、蛋白酶活力等指標為正效應(yīng)，其計算公式為：

(2)

公式(1)和(2)中，yi是大曲各指標歸一化值；xi是大曲各指標測定值；xmax和xmin分別是大曲各指標測定的最大值與最小值。

大曲理化(Y1)、生化(Y2)和綜合指標(Y)的計算公式為：

(3)

(4)

Y=Y1+Y2

(5)

1.3.6 大曲微生物指標綜合評定方法

大曲微生物主要包括細菌和真菌，微生物的生物量可以體現(xiàn)出大曲的發(fā)酵性能，也可以反映出大曲的發(fā)酵狀態(tài)，對大曲質(zhì)量影響也較大。對真菌和細菌的權(quán)重設(shè)置為7∶3[4]，大曲微生物綜合評定得分為M，對樣品進行綜合評分，計算公式為：

(6)

公式(6)中，M是大曲微生物指標綜合得分；x細i、x真i是大曲細菌和真菌的生物量值；x細max、x真max是大曲細菌和真菌生物量的最大值；x細min、x真min是大曲細菌和真菌生物量的最小值。

1.3.7 大曲綜合評價指標處理法

為了消除大曲各指標數(shù)量級和量綱對其加權(quán)評分值的影響，感官評分S、生化和理化指標Y和微生物指標M用公式(2)將其標準化，標準化之后分別用Z1、Z2、Z3表示。用線性加權(quán)法確定大曲綜合評價函數(shù)為Z，計算公式為：

Z=λ1Z1+λ2Z2+λ3Z3

(7)

公式(7)中，λ1、λ2、λ3分別為Z1、Z2、Z3的加權(quán)系數(shù)，滿足λ1>0、λ2>0、λ3>0，且三者之和等于1。通過查閱文獻[7]，了解到大曲各指標對其質(zhì)量及釀酒生產(chǎn)貢獻的大小，取λ1=0.2、λ2=0.5、λ3=0.3，所以大曲指標綜合評價函數(shù)Z的表達式如下：

Z=0.2Z1+0.5Z2+0.3Z3

(8)

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲理化指標的動態(tài)分析

大曲理化指標是評價大曲質(zhì)量的重要組成部分，能反映微生物的結(jié)構(gòu)分布和代謝途徑。水分含量在制曲過程中與微生物的生長和酶的生成密切相關(guān)。由圖1可知，單層大曲和雙層大曲水分變化總體呈降低趨勢，發(fā)酵9 d后雙層曲的水分含量較單層曲低，這是因為雙層曲曲溫較高，水分的擴散蒸發(fā)速度更快，但最終單雙層曲含水量趨于一致；大曲水活度在發(fā)酵前12 d降低緩慢，而在后期降低速率較快，這是由于單層大曲和雙層大曲微生物先后再次大量繁殖，消耗了自由水[15]；貯存2個月后單層大曲和雙層大曲的水活度都趨于0.62左右，此時微生物幾乎停止代謝而處于休眠狀態(tài)。

圖1 水分和水活度的變化Fig.1 Changes of moisture content and water activity

圖2 酸度和淀粉含量的變化Fig.2 Changes of acidity and starch content

由圖2可知，大曲酸度隨著發(fā)酵時間呈波浪式上升，大曲中酸度的增加主要是由于大曲中生酸菌的生酸作用，尤其是醋酸菌和乳酸菌等，最終酸度分別為1.46 mmol/10g和1.52 mmol/10g；單層大曲在發(fā)酵9～12 d時酸度短暫上升，可能是因為高溫刺激了某種產(chǎn)酸耐熱芽孢桿菌的生長導(dǎo)致酸度增加[16]；單層大曲和雙層大曲在發(fā)酵前20 d淀粉含量差異較大，由于采用的樣品未處于絕干狀態(tài)，水分降低速度相對較快，淀粉變化總體呈上升趨勢；在貯存期時兩者含量相近并趨于穩(wěn)定，最終淀粉含量在54%左右；發(fā)酵1～3 d單層大曲淀粉含量有一個明顯的降低趨勢，而雙層大曲則恰好相反，說明單層大曲中霉菌和酵母菌生長更為旺盛，單層大曲的穿衣效果也較雙層大曲要好。

2.2 大曲生化指標的動態(tài)分析

大曲的生化指標是衡量大曲質(zhì)量的重要指標，由圖3可知，發(fā)酵過程中單層大曲和雙層大曲的液化力總體來說都先增加后降低，最后在貯存期趨于平穩(wěn)，單層大曲液化力高于雙層大曲；發(fā)酵1～6 d單層大曲的液化力增長較快，且較雙層大曲液化力高；發(fā)酵12 d至發(fā)酵后期明顯回升，發(fā)酵20 d時達到最大值，單雙層曲的液化力分別為1.8 g/(g·h)和1.2 g/(g·h)；由于缺乏營養(yǎng)物質(zhì)和水分，微生物無法進行正常的代謝生長[17]，發(fā)酵20 d至貯存期大曲液化力顯著降低且2種大曲液化力相差不大；糖化力在發(fā)酵前3 d明顯下降，且雙層大曲糖化力要大于單層大曲，在發(fā)酵12～20 d單層大曲糖化力要大于雙層大曲，且雙層大曲糖化力顯著性下降，此階段雙層大曲曲溫較單層大曲高，高溫條件抑制或殺死了這類微生物，使得糖化酶代謝減少；大曲經(jīng)歷貯存期后糖化力降到最小值[18]，且單層大曲較雙層大曲高，分別為256 mg/(g·h)和233 mg/(g·h)。

圖3 液化力和糖化力的變化Fig.3 Changes of liquefaction and saccharification levels

由圖4可知，發(fā)酵前3 d單層大曲和雙層大曲發(fā)酵力都呈上升趨勢，此時酵母菌生長較為旺盛，并且單層大曲發(fā)酵力要高于雙層大曲；發(fā)酵3 d后大曲發(fā)酵力呈現(xiàn)出降低趨勢，這是由于發(fā)酵初期溫度對酵母菌起到一個高溫篩選作用，少部分能耐熱的酵母菌存活了下來，隨著后期發(fā)酵溫度的降低，一些酵母菌又開始大量繁殖；經(jīng)過2個月貯存后，大曲發(fā)酵力達到1個較低水平，單層大曲發(fā)酵力高于雙層大曲，分別為0.6 g/(g·72h)和0.3 g/(g·72h)；大曲氨態(tài)氮的量總體呈現(xiàn)降低的趨勢，在貯存期趨于穩(wěn)定，單層大曲和雙層大曲在發(fā)酵過程中變化波動都較大，說明大曲微生物代謝揮發(fā)性風味化合物具有時期性而不是連續(xù)性代謝產(chǎn)生；沈才洪等[14]認為，氨態(tài)氮和淀粉消耗率是大曲生香力的特征指標，發(fā)酵第9天的大曲處于排潮生香期，在發(fā)酵過程中氨態(tài)氮被微生物利用，從而使其含量降低，此外，隨著發(fā)酵過程中溫度的升高也可加速美拉德反應(yīng)的進行，使得氨態(tài)氮的量減少[10,19]；貯存2個月后大曲氨態(tài)氮的量處于較低水平為356 mg/100g，此時大曲具有濃郁的曲香味。

由圖5可知，隨著發(fā)酵時間的增加，單層大曲酯化力緩慢上升后趨于穩(wěn)定，且波動相對較小，而雙層大曲酯化力在發(fā)酵前6 d波動較大；發(fā)酵前6 d單層大曲酯化力較雙層大曲高，而在發(fā)酵9 d后則相反，可能原因是高溫條件能在一定程度上刺激產(chǎn)酯化酶微生物的生長；貯存2個月后單層大曲酯化力大于雙層大曲，分別為391 mg/(50g·7d)和371 mg/(50g·7d)；隨著發(fā)酵時間的增加，大曲蛋白酶活力呈現(xiàn)出緩慢增加的趨勢，單層大曲和雙層大曲在此過程中交替出現(xiàn)升高降低的波動變化現(xiàn)象；單層大曲和雙層大曲在發(fā)酵后期分別達到最大值，分別為106 U/g和108 U/g，而在貯存期時又急劇降低，使酶活處于較低水平，且單層大曲酶活較雙層大曲高，此時蛋白酶活力分別為18 U/g和13 U/g。

圖4 發(fā)酵力和氨態(tài)氮的變化Fig.4 Changes of fermentation force and ammonia nitrogen content

圖5 酯化力和蛋白酶活的變化Fig.5 Changes of esterification level and protease activity

2.3 濃香型單層大曲和雙層大曲微生物量測定

通過熒光定量實時PCR法分別得到單層大曲和雙層大曲真菌ITS和細菌16S rRNA基因的拷貝數(shù)，從而得到發(fā)酵過程中真菌生物量和細菌生物量及變化規(guī)律，即表3、表4所示。

表3 單層大曲微生物量Table 3 Fungal biomass of single-layer Daqu

表4 雙層大曲微生物量Table 4 Fungal biomass of double-layer Daqu

由表3可知，單層大曲發(fā)酵過程中前1～3 d真菌生物量增加較快，發(fā)酵第6天生物量相對減少，而6 d后真菌生物量緩慢增加，經(jīng)過貯存期后生物量相對穩(wěn)定，發(fā)酵第20天時生物量達到最大；單層大曲中細菌16S rRNA基因拷貝數(shù)總體呈波浪式變化，在第6天時生物量達到最大，與發(fā)酵第6天相比第9天有一個明顯的減少趨勢，同樣的相比于第12天，發(fā)酵第15天生物量也有一個明顯的減少趨勢，說明2次翻曲對細菌生物量的減少有一定促進作用。

由表4可知，雙層大曲在發(fā)酵1～3 天真菌生物量明顯增加；第6天時生物量減少；而發(fā)酵第6天后真菌生物量有所回升，經(jīng)過貯存期后生物量相對穩(wěn)定，發(fā)酵第15天生物量達到最大；雙層大曲中細菌生物量隨著時間的增加也呈現(xiàn)波動式起伏，但沒有單層大曲劇烈且每個發(fā)酵階段的生物量總體較單層大曲小，發(fā)酵第9天相對于第6天也有一個明顯的減小趨勢，說明第一次翻曲對細菌生物量的減少有一定促進作用。

2.4 大曲綜合評分

基于單雙層大曲的理化指標、生化指標、微生物量等數(shù)據(jù)，選擇樣品進行感官鑒定評分、生理生化指標評分、微生物指標評分，用科學的評價體系代替主觀性較強的感官評定，最后對以上指標進行綜合判斷，從而評價單雙層大曲質(zhì)量的好壞。

由于貯藏期的大曲樣品理化、生化、微生物量趨于穩(wěn)定，因此選擇S1M、S2M、D1M和D2M樣品通過表1的評分方式進行感官鑒定評分，最終得到平均分分別為93、92、81、79。按照表2的理化和生化指標參數(shù)設(shè)置及權(quán)重分配情況將大曲的理化、生化、微生物指標值進行分配，并帶入相應(yīng)的計算公式，得到感官鑒定得分、生化和理化得分、微生物得分和大曲綜合得分(表5～表8)。

表5 感官鑒定得分Table 5 Sensory evaluation scores

表6 生化和理化指標得分Table 6 Physicochemical and biochemical indexes scores

表7 微生物指標得分Table 7 Microbial indexes scores

表8 大曲綜合得分情況Table 8 Comprehensive scores of Daqu

由表8可知，貯存期大曲樣品中S2M綜合得分最高為0.89分，D2M得分最低為0.21分，得分大小情況為S2M>S1M>D1M>D2M，由此可知，單層大曲的質(zhì)量要較雙層大曲好。在對大曲感官評分(S)過程中發(fā)現(xiàn)雙層大曲穿衣效果、菌絲飽滿度和曲香味較單層大曲差。在對大曲理化和生化指標評分(Y)過程中發(fā)現(xiàn)蛋白酶活力在雙層大曲評分中較低，而液化力、糖化力、發(fā)酵力的評分隨著貯存時間的增加在雙層大曲中不斷的降低。而對微生物指標評分(M)過程中發(fā)現(xiàn)雙層大曲真菌生物量的得分較低，對其評分影響較大。綜合來看，單層大曲的質(zhì)量好于雙層大曲。

2.5 大曲各指標間的相關(guān)性分析

大曲各指標間均存在相互影響關(guān)系，大曲各指標間的相關(guān)性分析結(jié)果見表9、表10。

表9 單層大曲指標間相關(guān)性分析Table 9 Ccorrelation analysis of single-layer Daqu indexes

注：*表示在0.05水平上顯著相關(guān)，**表示在0.01水平上顯著相關(guān)。

由表9可知，單層曲真菌生物量與水活度的相關(guān)性系數(shù)為-0.575，說明水活度與真菌生物量呈負相關(guān)[17]；真菌生物量與蛋白酶活力、液化力、發(fā)酵力的相關(guān)性系數(shù)分別為0.446、0.607、-0.489，說明真菌生物量與蛋白酶活力、液化力呈正相關(guān)，與發(fā)酵力呈負相關(guān)。細菌生物量與水活度的相關(guān)性系數(shù)為0.639，說明水活度與細菌生物量呈顯著(p<0.05)正相關(guān)；細菌生物量與糖化力的相關(guān)性系數(shù)為0.476，說明細菌生物量與糖化力呈正相關(guān)。蛋白酶活力與液化力、糖化力的相關(guān)性系數(shù)分別為0.803、0.656，說明蛋白酶活力與液化力呈極顯著(p<0.01)正相關(guān)，與糖化力呈顯著(p<0.05)正相關(guān)。糖化力與水活度呈顯著(p<0.05)正相關(guān)，發(fā)酵力與水活度呈正相關(guān)。

表10 雙層大曲指標間相關(guān)性分析Table 10 Correlation analysis of double-layer Daqu indexes

注：*表示在0.05水平上顯著相關(guān)，**表示在0.01水平上顯著相關(guān)。

由表10可知，雙層曲真菌生物量與蛋白酶活力、液化力的相關(guān)性系數(shù)分別為0.657和0.588，說明真菌生物量與蛋白酶活力呈顯著(p<0.05)正相關(guān)，與液化力呈正相關(guān)；細菌生物量與水活度的相關(guān)性系數(shù)為0.658，說明水活度與細菌生物量呈顯著(p<0.05)正相關(guān)；細菌生物量與發(fā)酵力的相關(guān)性系數(shù)為0.571，說明細菌生物量與發(fā)酵力呈正相關(guān)；蛋白酶與液化力呈顯著(p<0.05)正相關(guān)；糖化力與水活度呈極顯著(p<0.01)正相關(guān)；發(fā)酵力與水活度呈正相關(guān)。

3 結(jié)論

從理化指標來看，單層大曲和雙層大曲理化性能變化差異不大，貯存期單層大曲和雙層大曲水分含量及水活度近似，總體呈降低趨勢；在酸度方面，雙層大曲略高于單層大曲的酸度(1.52 mmol/10g>1.46 mmol/10g)；在發(fā)酵前20 d單層大曲淀粉含量高于雙層大曲淀粉含量，而在貯存期時二者含量相近并趨于穩(wěn)定，最終淀粉含量在54%左右，單層曲的穿衣效果較雙層曲要好[20]。

從生化指標來看，在發(fā)酵期液化力最大值，分別為1.8 g/(g·h)和1.2 g/(g·h)，貯存期大曲液化力顯著降低，單層大曲的液化力略高于雙層大曲；大曲經(jīng)歷貯存期后糖化力降到最小值，且單層大曲較雙層大曲高[256 mg/(g·h)>233 mg/(g·h)]；經(jīng)過貯存期后單層大曲發(fā)酵力大于雙層大曲[0.6 g/(g·72h)>0.3 g/(g·72h)]；貯存2個月后單層大曲酯化力大于雙層大曲[391 mg/(50g·7d)和371 mg/(50g·7d)]；單層大曲酶活較雙層大曲高，貯存期分別為18 U/g和13 U/g。

單層大曲的質(zhì)量要較雙層大曲好，雙層大曲在感官鑒定中的穿衣效果、菌絲飽滿度和曲香味等項目的評分較低，在理化和生化指標評價中的蛋白酶活力項評分較低，而液化力、糖化力、發(fā)酵力的評分隨著貯存時間的增加在不斷的降低，而在微生物指標評價中的真菌生物量得分較低，最終導(dǎo)致雙層大曲評分較低；在雙層大曲發(fā)酵過程中，水活度與細菌生物量呈顯著(p<0.05)正相關(guān)，與糖化力呈極顯著(p<0.01)正相關(guān)；真菌生物量與蛋白酶活力呈顯著(p<0.05)正相關(guān)；蛋白酶活力與液化力呈顯著(p<0.05)正相關(guān)。